原文来自:Wu B G, Segal L N. Lung Microbiota and Its Impact on the Mucosal Immune Phenotype.[J]. Microbiology Spectrum, 2017, 5(3).
简介
2007，美国国立卫生研究院(NIH)医学研究路线图增加了人类微生物组项目(HMP)，自那时以来，已投资二亿多美元用于人类微生物群的开发。HMP(1)研究了人体上的几个部位，包括鼻部、口腔、皮肤、胃肠道和泌尿生殖道。胃肠道仍然是迄今为止研究的最深入的器官-微生物群相互作用，其在形成宿主免疫反应中的作用在炎症反应(2-4)背景下迅速被定义。观察发现，肥胖(5-8)、冠心病(9-12)、艰难梭菌结肠炎(13、14)、2型糖尿病(15、16)和炎症性肠病(4、17、18)与特定微生物和肠道微生物群有关联。当鼻孔和口腔作为HMP的研究对象时，下气道呼吸系统不包括在感兴趣的位置。甚至在下一代测序和多路复用数据(19，20)的进展之前，口咽的微生物群落就已经被描述得很好了。微生物群进入上下呼吸道系统，在健康和疾病中，宿主和微生物之间产生了大量的联系(21-23)。在过去的几年里，我们对气道微生物群的理解发生了变化，推翻了肺是无菌场(24)这一古老的格言，变成了一个连续器官系统的新范式，它具有丰富而充满活力的粘膜表面，体现了微生物体与宿主之间的复杂相互作用，能够导致或抵抗疾病(21，24)。此外，关于呼吸微生物群如何与宿主免疫反应相互作用，人们知之甚少。虽然多个研究项目侧重于肠道微生物对胃肠道粘膜免疫反应的影响(25-27)，但很少有论文着重于下气道微生物对其所居住的呼吸粘膜的影响(23，28-30)。研究下气道微生物群的一些独特挑战包括：下呼吸道采样技术困难，健康肺中细菌负担极低，导致低信噪比，以及缺乏研究肺微生物体的动物模型(31，32)。含有高细菌生物量的器官系统中胃肠微生物组成的变化，如胃肠道，可导致广泛的观察，导致疾病状态(33)。然而，肺微生物群是一种低细菌负担器官，其微生物群的瞬时扰动对其组成的多样性和宿主对失调的炎症反应有显著的影响(23)。因此，上下呼吸道微生物群是独特的，因为它代表了一个具有显著生物量梯度的器官，从上呼吸道的一个高细菌负荷库转移到肺微生物体中的一个非常低的细菌负荷区(32，34)。我们将首先讨论上呼吸道和下呼吸道的微生物群，然后讨论微生物迁移和定植的可能机制，然后是最近发现的对微生物群的宿主免疫反应、微生物群可能影响的炎症途径，最后是针对特定疾病的可能的微生物靶标或标记物。
气道微生物群只能被理解为其各个部分的总和。在上气道，鼻腔和口腔包含一个非常独特的微生物群。在鼻腔内，微生物区系以链球菌、不动杆菌、乳球菌、葡萄球菌和棒状杆菌富集为特征。在口腔，微生物区系以富集Prevotella、链球菌、镰刀菌、Neisseria、Leptotrihia和Veillonella(35)为特征。进一步确定每个位置的质量，上气道的特点是不断暴露于空气中的微生物和微生物，作为每个人的饮食的一部分。尽管呼吸系统及其粘膜是一个连续体，但下呼吸道微生物区系有非常独特的特征，使其与上呼吸道不同。我们定义的上下气道之间的界限是由解剖结构来定义的，声带类似于一个天然的“水坝”来反对呼吸(36，37)。类似于水坝所持的水，上气道保持较高的细菌负担，而下气道微生物区系的细菌负荷则少约100至10000倍，根据16S rRNA拷贝数(32，38)。微吸入发生在正常人(39)中，其患病率在几种肺部疾病中较高，包括慢性阻塞性肺疾病(COPD)、哮喘、阻塞性睡眠呼吸暂停、囊性纤维化和非典型(如非结核分枝杆菌)和典型微生物(40-45)引起的肺部感染。
Charlson和他的同事在最初的研究中，检查了6名健康患者的支气管镜检查结果，并得出结论：下呼吸道类似上呼吸道微生物群(32)。进一步的无细胞支气管肺泡灌洗(Bal)的微生物组研究发现，口腔的细菌特征在45%的相对健康的受试者中发现，其余受试者有一个类似背景分类群(23，30)的肺微生物群。其他研究发现，口腔细菌的特征在较高的出现率，虽然这是不清楚是否与使用的样本类型(脱细胞BAL与整个BAL与气道刷)或在队列中的差异(32，46-48)。重要的是，下气道微生物区系的二分法观点(由上气道微生物富集而非)可能是下气道微生物群更可能的生理连续体的过度简化。值得注意的是，使用放射性示踪剂的较早的研究发现，类似比例的健康人微吸物(39，49)。利用独立培养技术，各种研究表明，常见于上气道的细菌也经常出现在多种疾病状态，如：哮喘(29，50-58)，囊性纤维化(59-62)，人体免疫缺陷病毒(HIV)感染(47，63，64)，晚期COPD(21，23，28，65，66)。考虑到气道粘膜的连续性，上呼吸道微生物群以其高细菌负担成为下气道微生物的主要来源，这一点不足为奇。然而，即使下气道被口腔中发现的微生物富集，上呼吸道和下呼吸道微生物群之间仍有差异(30，32)。这表明，还有其他重要因素影响下气道的动态稳态。有几个问题还没有得到回答：1)不同粘膜微生物对下气道的“异花授粉”有什么贡献；2）微生物进入下气道时受到的选择压力是什么；3)在下气道的不同室内，这种选择压力是如何变化的。
肺微生物组评价的独特挑战
肺微生物学研究尚未解决的一个特殊挑战是，在健康和早期疾病期间，微生物群信号与背景噪声的比率(图1)(31)。虽然这在晚期疾病中也很重要，但在疾病的早期阶段，在下气道样本中微生物生物量较低的情况下，信噪比是非常不利的。在功能上，肺部的细菌负担比上气道低100到10000倍(23，38)。因此，肺部系统的低细菌负担性质带来了独特的挑战：以高背景噪声信号(31)为特征的信噪比、缺乏标准的背景去除方法以及从低丰度分类群中检测信号的能力有限。这些挑战使肺部微生物群难以研究。在多项研究中，一个一致的发现是背景环境样本，如无菌盐水和支气管镜前通过支气管镜清洗(在手术之前)，含有微生物DNA，其特征是具有多样性的环境背景微生物群(30，31)。这是可以理解和可预测的，因为仪器是“干净的”，但不一定是无DNA的。此外，用于DNA分离和文库制备的试剂也可能有助于背景DNA(67)。有很大比例的健康受试者有丰富微生物DNA的下气道微生物区系，这是背景样本的特征(21，23)。因此，背景微生物群可能会使大约60%的健康受试者中的低生物量宿主微生物群发生混淆，这些微生物群将具有丰富的背景优势类群(又称肺炎菌群)(23，30)。即使在这些主题中，确定背景分类群(例如SourceTracker)对样本的贡献的生物信息方法也表明，背景样本(例如支气管镜)中近一半成分是BAL样本中没有的(30)。这一数据表明，从这些低生物量样本中仍可获得大量信息。与胃肠道的微生物群比较，这种高细菌负担和多样化的微生物群落受到多种微生物的挑战(例如食物摄入、药物治疗等)。在这种情况下，背景微生物群很少被视为重要的污染源。然而，背景微生物区系可能影响稀有或较少数量微生物的回收，或在总体污染环境中，可能在掩盖细菌组成方面起作用。由于不同的微生物或活跃的疾病过程而引起的微生物变化更有可能在胃肠道中被发现(图1A和1C)。相反，呼吸道细菌负担低，使用独立培养技术的微生物评估通常受到背景微生物群的影响。因此，当微生物干扰肺部微生物群时，由于低信号需要克服高背景噪声(图1B和1D)，它们可能不明显。该模型还表明，该信号可能是短暂的，并受动力学控制的微生物宿主在下呼吸道相互作用。当面对上气道(URT)微生物挑战时，呼吸系统的低微生物负荷可能导致微生物群的大幅度转移。微吸入术引起的微生物挑战可被看作是下气道微生物群与上呼吸道微生物的富集(也称为声门上优势类群的肺炎)(23，30)。低微生物量和信噪比是研究肺部微生物群的一个明显挑战。因此，必须将背景微生物群的研究纳入低生物量样品的微生物群研究中。
在研究下气道微生物群时，如何处理背景类群仍有疑问。测序数据的处理通常包括去除技术污染，可以作为数据上游处理的一部分进行分类群的处理。中性建模是一种可以用来识别样本类型(68)上优先富集的分类群的技术。被取样的分类群发现，偏离这一模型的是最有可能是真正的“居民”。例如，这项技术可以用来去除支气管镜中发现的分类群，以识别肺部内的微生物。SourceTracker是另一种用于估计背景微生物群(例如支气管镜)来源对生物样本(69)的微生物贡献程度的技术。虽然这些方法已被应用于肺微生物学研究中，但对于如何规范分析还缺乏共识。一个关注的问题是，在背景分类群占优势的样本中(例如，肺炎生物分类群)，去除背景分类群可能产生低读取量，并且鉴于微生物群数据的相对丰富性，将夸大未被移除的分类群的相对比例。此外，分类群清除方法有可能排除肺部和可能的污染源(如支气管镜)中存在的分类群，这可能对理解下气道微生物区系有意义。最后，细菌在疾病状态下可能具有重要的致病作用，尽管它在微生物群落中的丰度较低，去除背景分类群实际上可能改变我们对微生物在肺中的作用的理解(70)。例如，对肠毒素性大肠杆菌引起的实验性腹泻的序列分析表明，即使这种细菌丰度低，也会引起重大疾病(71）。因此，在肺中，高丰度的背景噪声是一个重大的挑战，要从低丰度的分类群中检测微生物中的信号，但可能对健康和疾病具有重要的生物学意义。
下气道微生物挑战的来源
可以预见的是，微生物来源于下呼吸道的最直接的解释是通过微吸入法从上呼吸道输送的微生物。虽然人们普遍认为口腔分泌物的吸入可能会影响肺部微生物群，但必须考虑其他可能的来源。在周围空气中的微生物群可能是下呼吸道的重要来源。人体每天能呼吸大约7000至20000升的环境空气(24，72升)，使下呼吸道暴露于空气中的微生物(空气中的微生物区系)，以及其他公认的污染物、化学物质、灰尘、过敏原和其他来自大气的微粒物质。虽然对被气溶胶化并可传播感染的病原体，如分枝杆菌(73，74)有很多的了解，但对空气中其他微生物的存在和相关性所知甚少。可能不同的空气中微生物群也可能对下气道微生物群有显著的贡献，这一课题还需要进一步的研究。
人们对复杂的空气微生物群及其对下气道微生物群的贡献有越来越多的了解。亚当斯和他的同事发现，室内环境和室外环境之间的差异是由人类相关微生物决定的(75)。在室内环境中，他们发现了棒状杆菌、链球菌、葡萄球菌、丙酸杆菌、乳球菌和肠杆菌科细菌的富集。在室外环境中，假单胞菌、Acinetobacter和Sphingomonas(75)富集。同时，Meadow和他的同事发现了一种独特的“微生物云”，它支持在封闭的空间内，周围的空气会受到其居住者的影响(76)。然而，暴露于不同空气中的微生物对肺微生物群的影响或呼出空气微生物群对空气环境微生物群的影响还没有得到研究。鼻腔微生物群与口腔微生物区系(35)不同，很可能是吸入周围空气富集的下气道的一个重要微生物库。
慢性鼻窦炎的培养独立方法已显示出流感嗜血杆菌(77，78)和其他病原体的富集，这些病原体经常与肺炎的发展有关。鼻后滴鼻与咳嗽和支气管炎症性疾病密切相关，但其对下气道微生物的影响尚未阐明。胃肠道是微生物对肺部微生物群的另一个潜在来源。胃食管反流病(GERD)在许多疾病状态中经常存在。以幽门螺杆菌为主的肠道中存在独特的微生物群，与哮喘的风险降低有关(79，80)。质子泵抑制剂的使用不仅影响胃微生物区系的组成，而且影响肺微生物群(81)的组成。此外，下消化道应被认为是潜在的肺部微生物来源。脓毒症动物模型显示，无菌动物可免受肺损伤(82)，而选择性胃肠道去污则可减少50%人(83人)多器官功能障碍综合征的发展。
然而，在下气道最常见的观察到的微生物是那些特征存在于口腔的。多元培养独立调查显示，不同受试者对口腔微生物如Prevotella、Veillonella、Rothia、 Streptococcus和Porphyromonas(23、30、65、84、85)的富集程度不同。因此，多个潜在来源可能通过不同途径的微生物攻击，如吸入、反流、血源和雾化吸入，促进下气道微生物群的形成。这些微生物挑战将成为在下气道环境中存在的独特选择压力的对象。虽然对这些选择压力在个别水平上的了解有限，但它们很可能对可能居住在较低空气通道的微生物群落的结构产生非常重大的影响。
下呼吸道微生物群独特的选择压力
几种不同的理论已经从生物学、生态学和环境研究中被用来解释肺微生物群的组成。其中最有号召力的是经改编的岛屿模式(86-88)。与岛屿相似，肺部受到来自“主陆地”微生物的迁移和它们的灭绝(86，87)之间的平衡的影响。根据这一理论，肺部可以被视为接受移民挑战的概念“岛屿”，最常见的是来自上呼吸道。因此，肺部的多样性主要是由来自微生物挑战来源的多样性和微生物生存能力的选择压力所驱动的。
近端气道，包括气管和主支气管，可被视为大面积的区域，因为它们相对于上呼吸道的位置更接近上呼吸道(32)。当汕头一个人的下呼吸道前进时，传导的气道可能代表孤立的岛屿(87，89)，有可能整合一个独特的微生物生态位。因此，多样性受到三个主要因素的影响：迁移率、淘汰率和社区成员的繁殖率(86-88，90)。健康时，这些岛屿的多样性主要取决于上呼吸道的迁移和各种清除机制，包括粘液纤毛梯、噬菌体和肺泡巨噬细胞。在健康个体中观察到的微吸入术的频繁发作很可能是微生物气道挑战的最主要来源。在发生疾病的情况下，不同的因素可能影响肺微生物群。例如，在活动性肺炎中，慢性气道定植在慢性阻塞性肺病(COPD)或囊性纤维化中，机体在下气道的繁殖率将抵消迁移和消除的机制。
此外，气道粘膜有几个独特的特点：它是一个中空的黏膜内衬管系统，在环境空气中不断地进行气体交换；它含有较高的表面活性剂(91)形式的磷脂；由于它的气体交换性质，它存在氧气和二氧化碳压力的梯度(92)。因此，微生物进入下气道时，必须克服或适应肺环境的变化。最近的研究表明，通过评估宿主内部微生物遗传变异，多个谱系可以共存，为下气道(93)提供选择性压力的证据。几个环境因素存在于下气道，使其有可能形成下气道微生物群。富含磷脂的环境不仅对维持表面张力和通气肺泡有重要作用，而且对微生物代谢(94)也有显著影响。呼吸道中存在多种抗菌肽，如表面活性蛋白A、乳铁蛋白和防御素。实验结果表明，分泌型免疫球蛋白A(SIgA)在气道微生物区系中起重要作用，其缺乏症可引起肺内微生物群炎症反应的增加，并引起气道重塑和肺气肿(95)。因此，肺粘膜的抗菌特性是微生物定植的重要障碍。为了逃避或改善宿主防御的影响，微生物已经开发和进化出了特定的机制。例如，生物膜构成自己的微生物生态位，厌氧菌可以找到最佳厌氧生态位(96)。例如，铜绿假单胞菌有利地利用生物膜来创造自己的微环境(97)。生物膜，靠好氧和厌氧菌，以及开发缺氧的微环境，可能允许微生物在厌氧条件下定植(98)。因此，虽然肺是一个高度通气的器官，但厌氧菌常在下气道微生物群中被描述，这表明生物膜可能对下气道内的有氧和厌氧菌的共存起着重要作用(96，98)。具有不同粘附性能的微生物也受到机械选择压力的不同影响，如粘液纤毛间隙(99，100)。不同的细菌表达粘附素、枕叶蛋白和鞭毛素，以克服下气道粘液纤毛的去除(101，102)。这些是细菌定植和致病的重要毒力因子，并非所有细菌都表现出这些优势。因此，在呼吸系统中发现的微生物很可能反映了一种高度专业化的菌株或物种，它们与高度免疫的粘膜(103，104)保持恒定的平衡。需要实验方法来研究这些因素如何影响选择压力，形成下气道微生物群。
肺环境生态系统也可以被认为是一系列的正向和反馈循环，抑制或允许潜在的肺细菌生长(88)。在医院环境下肺炎的一个主要危险因素是抗生素的使用(105)。有证据表明，在疾病发生前，肺部就有可能存在导致肺炎发展的病原体。在这一理论的小鼠模型中，Poroyko和他的同事对脂多糖(LPS)所致的急性肺损伤进行了研究，并研究了小鼠肺微生物组(106)的变化。这些老鼠在没有增加物种数量的情况下，明显地增加了细菌负担。此外，Proteobacteria科的丰富度也有所增加，而Firmicutes细菌的数量也有所减少。这些发现表明，对LPS的挑战可能会压倒肺内平衡的反馈机制，从而使肺内的微生物在压力和炎症期间不受抑制地增殖。营养供应也可能影响肺微生物群(107)的改变。铁的可获得性和营养免疫等问题可能会选择能够适应某些营养缺乏或丰富的微生物。此外，与病毒共感染也可能影响肺的平衡。Molyneaux和他的同事证明，当下呼吸道微生物群受到鼻病毒感染时，会发生内在的变化。在本研究中，健康受试者和有慢性阻塞性肺疾病病史的人被鼻病毒感染，并在四十二天(108年)内进行纵向追踪。通过诱导痰，作者发现鼻病毒攻击导致了Proteobacteria的增加，主要是由流感嗜血杆菌(108)的增加所驱动。这也许可以解释为什么下呼吸道肺炎发生在病毒感染后。宿主免疫系统的变化将影响下气道微生物的选择压力。这一选择的一个例子是惠普尔氏病的病因之一—Tropheryma Wapplei在治疗的肺中富集，感染HIV的患者和随后的抗逆转录病毒治疗后的T.wpplei相对丰度下降(64)。重要的是，由于在上呼吸道样本或背景对照中没有发现这种微生物，它似乎反映了宿主免疫缺陷状态有利于或促进下呼吸道的真正居民生长。最近，在晚期HIV中发现了更广泛的微生物差异，免疫重建(109)部分纠正了这种差异。Twigg和他的同事发现，在接受抗逆转录病毒疗法(ART)治疗1年后，HIV感染者的肺中发现了链球菌、Prevotella和Veillonella(63)。此外，越来越多的证据表明免疫缺陷对肺部非细菌微生物的影响，如真菌生物群落中的真菌聚集(110)。宿主呼吸系统与环境和微生物的相互作用是了解上呼吸道微生物群在健康和疾病中所起作用的一个组成部分(21、23、30)。
宿主免疫应答中的特异性缺陷对微生物群起着重要的作用。Richmond和他的同事通过研究特异性分泌型IgA(SIgA)免疫缺陷(95)的影响，探讨了黏膜免疫功能的变化。研究人员建立了缺乏聚合免疫球蛋白受体(PIgR)的小鼠模型，不能在粘膜表面产生SIgA。pIgR缺乏导致肺部微生物侵袭持续激活炎症信号(95)。缺乏pIgR的小鼠肺中的分类群增加(400对194)。野生型小鼠相比，pIgR缺陷小鼠的分类群相对丰度较高，其中包括Veillonella、Prevotella、Neiseriaceae、Bacillus、放线菌科、Tissierellaceae和Ruminococcus(95)。此外，与在常规环境中饲养的pIgR缺乏小鼠相比，无菌pIgR缺陷小鼠并没有发展出类似COPD的表型。一旦将无菌pIgR小鼠从无菌环境和微生物区系中移除后，我们测量了类似水平的气道壁重塑、肺气肿和炎症，并发现与在常规(非无细菌)条件下饲养的pIgR小鼠相同的暴露时间(95)相当。pIgR缺乏小鼠肺组织NF-κB表达上调，与野生型年龄匹配对照组(95)比较，差异有显着性(P<0.05)。这一点很重要，因为慢性阻塞性肺病的结构异常与pIgR表达降低和保护性黏膜屏障破坏有关(111，112)。
药物的使用，特别是皮质类固醇，也可能影响宿主对微生物的反应。宿主免疫反应决定宿主对微生物的易感性，从而影响病原体与共生体的区别。在免疫反应不足或改变的情况下，有规律地定植或被宿主清除的微生物可能会引起疾病。黏膜相关不变T细胞(MAIT)是人类中一种普遍而独特的T细胞群，具有检测细胞内感染细菌的能力，其中包括结核分枝杆菌(113)。MAIT细胞识别细菌核黄素合成的早期中间产物，这些中间产物能够成为这些细胞的有效抗原(113)。虽然它们能够识别出各种各样的细菌微生物，但不表达核黄素合成途径的细菌并不能刺激MAIT细胞(114)。Hinks和他的同事们证明，在11例使用糖皮质激素的患者中，外周血清和支气管活检中MAIT细胞比健康对照组少(115)。在体外研究中，接触氟替卡松或布地奈德后，非类型流感嗜血杆菌(NTHi)感染来自健康的人巨噬细胞。这些皮质类固醇的存在显著降低了MAIT细胞巨噬细胞上的一种刺激受体MR1的表达，也使MAIT细胞中NTHi诱导的IFN-γ表达减少(115)。因此，类固醇诱导的MAIT细胞抑制可能是气道疾病患者肺炎风险增加的原因(115)。
独特的肺选择压力可能对肺微生物群产生深远的影响。越来越多的证据表明，适应海岛模型可能有助于模拟微生物从微吸入术对较低气道的挑战。一旦进入较低的气道，口腔微生物很可能暴露在多种选择压力下，这些压力决定了它们在肺中的持久性或暂时性。在进化上有优势以减轻和避免宿主免疫反应的微生物更有可能在下气道微生物群中持续存在。他们克服先天和适应性免疫系统的能力可能有助于指导未来的研究，以解决微生物调控的新途径，以及可能决定这些相互作用的特定分子模式。最重要的是，宿主的反应和药物值得特别关注，因为这些机制在目前的文献中还很大程度上还没有被探讨，因为它们对肺微生物群的影响。
疾病状态下的肺微生物群
Morris和他的同事在一项关于肺微生物组的研究(85)中研究了健康受试者和健康吸烟者的微生物群。他们发现，口腔冲洗和支气管肺泡灌洗(BAL)中最常见的属是口腔中常见的微生物(Prevotella、链球菌和Veillonella)。虽然这项研究确实发现肺中的微生物比口腔中的更多，包括嗜血杆菌、肠杆菌科和疣状杆菌，但没有发现吸烟者和不吸烟者之间肺微生物区系的差异(85)。然而，尽管肺内微生物组没有发现差异，但吸烟者的口咽区与不吸烟者的口咽区却存在差异。Neisseria，卟啉单胞菌和Gemella在他们的受试者的口腔冲洗中不存在(85)。其他几项研究表明，仅吸烟就足以改变上呼吸道微生物群(20，35)，但不足以改变下气道微生物群(23，85)。
接触烟草烟雾也会大大增加你患慢性阻塞性肺疾病(COPD)的风险。与吸烟者相比，慢性阻塞性肺疾病晚期患者在肺内微生物群中有明显的改变。Erbdown和他的同事描述了终末期COPD患者(84例)肺部微生物群的这些差异。重要的是，肺的不同区域有不同的微生物群。推测肺底层结构的改变和粘液纤毛清除能力的降低导致假单胞菌和链球菌(84)的富集。其他研究也描述了COPD患者肺微生物群的差异(28，65，116)。然而，大多数COPD微生物组的研究集中在黄金期IV期COPD和从移植肺采集的样本，在这些样本中，其他混杂物，如吸入类固醇和频繁使用抗生素普遍存在，可能会使肺微生物群混淆。Hilty和他的同事还描述了哮喘和中度COPD患者(58例)肺部微生物紊乱的情况。值得注意的是，这些患者中有60%人正在进行吸入皮质类固醇治疗。
失调也可能在COPD恶化中起作用。黄和他的同事研究了一组因慢性阻塞性肺疾病加重而住院的患者(n=8)。所有的患者都是机械通气，插管，并接受抗生素(117)。研究对象的人际细菌丰富度存在差异，受试者丰富度降低的较多的是假单胞科和肠杆菌科，而丰富度增加的具有较高的相对丰度的梭菌科、藻科、杆菌科和肠球菌科(117)。在解释这些结果时，一个具有挑战性的问题可能是研究对象在研究时接受了不同长度和类型的抗生素。因此，可能与COPD加重有关的肺微生物组的变化在疾病早期可能会丢失，所见的变化可能是由于对肺微生物组(117)的抗生素效应所致。
Pragman和他的同事研究了患有相对稳定疾病的中、重度COPD患者的肺微生物群，并将其与健康人进行了比较。他们发现，虽然中、重度慢性阻塞性肺疾病组有更多的共同OTUS，但很少有OTUS(约13%)在所有三组中共享(116个)。值得注意的是，研究发现肺内有几种厌氧菌，包括Bacteroidetes细菌、镰刀菌和梭菌属，观察到厌氧细菌是在有氧环境中发现的，但尚不清楚这些厌氧菌是否具有代谢活性(116)。在这项研究的亚分析中，作者发现最具判断力的因素是吸入类固醇的使用。强调药物对微生物组的影响，最近的一项研究表明，在早期肺气肿患者中，使用阿奇霉素会影响下气道微生物群的多样性，并增加可能具有抗炎作用的应激相关微生物代谢物(118)。该数据进一步支持下气道微生物组在下气道黏膜免疫表型中的作用，并说明药物的选择性压力。
利用移植肺的核心活检，Sze和他的同事也发现了晚期COPD患者的差异，相对高丰度的Firmicutes，包括乳酸菌和变形杆菌(65)。然而，在一项后续研究中，同一研究人员发现，当他们将COPD患者的肺标本与移植供者的肺标本进行比较时，Proteobacteria门的相对扩张和Firmicutes的减少(28)，说明很难定义一致的“核心”COPD微生物群。最近一项研究的一个重要发现是，有几个类群与宿主的免疫反应呈正相关和负相关，包括中性粒细胞浸润、嗜酸性粒细胞浸润和B细胞浸润(28)。
尽管有研究在黄金期IV COPD检查肺微生物组，早期COPD，中度COPD，和积极吸烟者仍然很难研究，并在肺微生物组的研究中表现出知识的缺乏。由于几个具有挑战性的问题，应注意这些人群，包括：需要研究疾病过程中的早期事件，控制和限制吸入糖皮质激素等可能的混杂因素，以及关注肺部微生物群的纵向变化。
在哮喘中，有证据显示有Proteobacteria富集，包括嗜血杆菌属(29，119)。重要的是，不同的免疫表型与下气道微生物群的变化有关。与无哮喘患者相比，哮喘患者的呼吸道细菌负担更高(119)。在幼年暴露于不同的过敏原和微生物(来自动物或环境)证明对哮喘的发展有保护作用，从而支持“卫生假说”(120，121)。相反，肺微生物群中的几个分类群，包括肺炎链球菌和流感嗜血杆菌，一旦在新生儿宿主中定植，就会增加哮喘的易感性(122)。黄和他的同事研究了患有肺部微生物紊乱的哮喘患者。他们发现气道的多样性与支气管高反应性增强密切相关(119)。此外，他们还发现，与支气管高反应性密切相关的分类群主要属于变形菌门。克拉霉素治疗结果显示，克拉霉素治疗后支气管反应性改善者的Shannon多样性指数(α多样性)(119)有所提高。
在严重哮喘患者中，黄和他的同事也试图对哮喘不同表型的患者的相关微生物群进行研究。他们发现，拟杆和厚壁门(包括Prevotellaceae、支原体科、Lachnospiraceae和Spirochaetaceae)的富集与肥胖的哮喘患者有关。他们还确定了与哮喘症状恶化有关的某些分类群，如Proteobacteria（Pasteurellaceae, Enterobacteriaceae, Neisseriaceae, Burkholderiaceae, and Pseudomonadaceae)(123）。研究人员证明，不同的哮喘表型可能隐藏着不同的微生物，支持肺微生物学体在宿主免疫表型上的一个重要方面(29)。在囊性纤维化中，气道清除紊乱是由于氯化钠通道功能障碍，导致分泌物增厚，并导致微生物气道定植和感染。根据培养的数据，在囊性纤维化患者的气道中发现了临床上有意义的细菌，包括铜绿假单胞菌(124)、头孢菌素复合物(124)、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(125)和鸟分枝杆菌复合物(126)。早期囊性纤维化的微生物群研究发现，囊性纤维化的核心微生物群可能由7个属的15个分类群组成，其中包括Catonella、Neisseria、Porphyromonas、Prevotella、Pseudomonas、Streptococcus和Veillonella(127)。囊性纤维化患者的肺可能存在高度的空间异质性(128)。在一项由Coburn和同事进行的269名囊性纤维化患者的研究中，研究人员研究了广泛的年龄和疾病阶段(128，129)。这项研究再次确认某些物种属于可能的核心微生物群，包括链球菌、Prevotella、Rothia、Veillonella和放线菌(129)。较典型的囊性纤维化相关微生物(如假单胞菌、伯克霍尔德菌、葡萄球菌和嗜铬杆菌)不太普遍，但当痰标本中出现时，往往占样本内相对丰度的主导地位(129)。
此外，Coburn和他的同事发现，10岁以下患者的群落多样性和肺功能最高，25岁时达到一个平台，随后几年社区多样性下降与肺功能恶化有关(129)。曾经被认为是口腔污染物的细菌可能是肺生态学(90，130)中重要的口腔微生物，也可能是囊性纤维化(131)宿主炎症反应的潜在来源。
肺肠轴及其在疾病中的作用
肠道是人体内微生物群的主要聚集地。有证据表明，胃肠道对宿主的免疫启动起着重要作用。这种免疫功能不仅限于肠粘膜或全身循环，而且有越来越多的证据表明，通过肠与肺之间的免疫关系相通。因此，胃肠道不仅可以与下呼吸道直接相互作用(例如吸入)，而且还可以作为免疫调节器官，与先天和适应性免疫系统(树突状细胞和巨噬细胞)有关的其他器官相互作用，并在疾病到呼吸道时可能具有炎性细胞因子和趋化因子(60、132、133)。
对哮喘的微生物群研究也发现了可能的肺和肠道相互作用。幼年接触牲畜或犬类的风险显著降低(134，135)。直到最近，保护这些人免受哮喘发展的机制仍未确定。藤村和他的同事们用从狗家收集的灰尘进行了实验来探索这种联系(25)。暴露在狗居住的房子灰尘中的老鼠对过敏原有保护作用。特别是，接受狗家尘的小鼠胃肠道中的johnsonii乳杆菌相对丰度增加(25)。口服补充这一单一种类的乳酸菌可降低支气管对过敏原和呼吸道合胞病毒的反应。此外，作者声称，虽然他们能够在盲肠标本中检测到约翰逊氏菌，但在肺标本中却没有检测到任何一种，证明胃肠道微生物群对局部和全身炎症反应有影响(25)。
囊性纤维化小鼠模型显示，由于抗生素治疗后肠道微生物群的改变肺微生物学体有明显的调节作用(136，137)。Bazett和他的同事们发现，链霉素在小鼠囊性纤维化模型中，这种抗生素不是从肠道系统吸收的，与野生型小鼠时相比，用链霉素(136)治疗的肺IL-17和γδT细胞减少有关。因此，肠道微生物群在囊性纤维化(138，139)中也起着重要的免疫调节作用。
肠道微生物群的变化也与人类异基因造血细胞移植的肺部并发症有关(140)。革马蛋白杆菌(Gammaprotein)–以肺炎克雷伯菌和氧化克雷伯菌为成员的粪便微生物群占主导地位，与肺部并发症有关，死亡率增加了一倍(140)，表明肠道有助于移植早期肠道细菌的移位，或可导致由微生物引起的局部或全身炎症途径造成的间接肺损伤。肠道微生物群也可以减轻和保护脓毒症(141-143)。用抗生素根除胃肠道微生物群与感染肺炎链球菌的小鼠体内存活率显著降低有关，肺炎链球菌感染后肺泡巨噬细胞的细胞因子(如IL-1β、IL-6和CXCL 1)表达上调，IL-10和TNF-α表达下调(144)。
肺-肠相互作用的程度仍需进一步澄清。这两个器官之间有着清晰的联系，两个器官都代表着很大面积的粘膜表面，它们可能有相似的免疫途径。因此，肠与肺的相互作用暴露出缺点，当描述肺部或肠道微生物组的免疫效应时。新的证据表明，肠-肺轴代表了这两个器官之间的交流和信息共享领域。未来的研究方向是定义和完善这些相互作用，并利用它们使宿主受益。
微生物对下气道环境炎症通路激活的影响
宿主呼吸系统与环境和微生物群的相互作用是理解上下呼吸道微生物群在健康和疾病中的作用的一个组成部分(21、23、30)。尽管目前肺微生物组文献中的例子很少，但有几份手稿已经证明了肠道微生物组在粘膜免疫系统中Th17反应的成熟中的作用(2，145-147)。在胃肠道文献中，有证据表明胃肠道微生物在健康和疾病中起着重要的免疫调节作用(2，146，147)。特别是，Th17反应在粘膜表面引起人们的兴趣，Ivanov和他的同事们证明，分段丝状杆菌(SFB)似乎在胃肠道Th17细胞的分化中起着一定的作用(2，147)。此外，Suzuki和他的同事证明，在IgA缺乏的小鼠模型中，异常和不受控制的免疫反应与SFB在这些小鼠体内的增殖有关(148)。总之，肠道微生物群在免疫反应的成熟中起着必要的作用。然而，肺微粒体也可能在粘膜免疫反应中发挥重要作用。
在肺粘膜中，健康患者微生物学组的变化与亚临床炎症有关(23)。在肺微生物群的二分法分组中，可识别出两种不同的肺微生物(肺型)：一种是以声门上优势类群富集为特征(肺门-图2)；另一种是以背景优势菌群富集为特征的肺炎型(肺炎菌群-图2)(23)。与上呼吸道的相似性程度也可以用来表征肺微生物群，在BAL中，以声门上占优势的类群(肺门为主分类群)富集BAL样本时，出现了较低的UniFrac距离(基于相对丰度和系统发育树的不同)，但这些分类群的代谢活性目前尚不清楚(93，149)。此外，这两种肺炎类型的队列组织(图2)得到了噬菌体数据的支持(30)。噬菌体数据的恢复表明，不同的噬菌体被选择到不同的类群中，说明肺的生态梯度可能影响病毒和微生物群。来自该群体的噬菌体数据也支持一个积极复制的噬菌体群体的存在，因此，为了有一个活跃的噬菌体群体，意味着也有一个活跃的微生物群落(30)。重要的是，富含口腔分类群的下气道微生物群与独特的基因组潜力有关，并与多种微生物来源的代谢物有关。这提供了在较低气道中微生物代谢活跃的证据。宿主不仅是下呼吸道微生物群相互作用的旁观者，而且还可以受到细菌代谢的副产品的影响或受益。最近的一项研究表明，阿奇霉素在早期肺气肿中的应用促进了细菌产生抗炎代谢物(118)，提示大环内酯类药物的一些抗炎作用可能是由其对下气道微生物代谢的影响所介导的。
此外，肺微生物群的差异与一种独特的免疫表型有关，表明肺微生物群不是旁观者的共生体，而是与宿主免疫系统相互作用。具体来说，声门上占优势的类群(肺炎)的富集与Th17的炎症表型有关(图2)。下气道微生物群最有可能是肺通气功能异常的积极参与者，与URT相似的标本也与Th17-趋化因子：IL-1α、IL-1β、Fractalkine和IL-7(30)有关。此外，对气道刷的转录组分析表明，对Th17分化重要的因素，如STAT 3和TSLP，与肺通气性小孢子虫有关。鉴于健康志愿者和那些接触香烟烟雾的人都发现了这些微生物群信号，这表明下气道的富集不受疾病影响(图2)。
其他研究也发现了与严重哮喘患者Th17表型相关的微生物特征(29)。这种表型发生的机制在肺中尚不清楚。黄和他的同事对严重哮喘患者的研究发现，Proteobacteria与Th-17相关基因的表达相关，包括Pasteurellaceae、肠杆菌科和Bacillaceae。虽然FKBP 5基因与哮喘中类固醇反应性相关，与Th17炎症相关，但与Proteobacteria特定科没有明显重叠，表明尽管有一个共同的门，但不同的微生物对下气道有不同的影响(29)。因此，独特的气道微生物群可能促进Th17相关炎症，但可能与FKBP 5相关的类固醇诱导效应无关(29)。与Th17炎症相关的微生物的鉴定可能是另一种独立于Th2和嗜酸性反应的炎症途径。Th17炎症表型可能是某些哮喘患者的重要免疫调节靶点，尤其是具有中性粒细胞表型的哮喘患者(29)。然而，Th2表型与微生物群数据(29)没有显著的相关性。
此外，Yadava和他的同事在实验小鼠模型的研究中发现，由于γδ+T细胞表型(150)的增加，暴露于LPS和弹性蛋白酶的肺微生物学体中，IL-17A的表达增加。这种小鼠的炎症表型与气道异常和肺气肿相似，类似于人类COPD。LPS和弹性蛋白酶对小鼠的BALα多样性降低，假单胞菌、乳酸菌和金杆菌(150)相对丰度增加。研究人员发现，微生物群通过使用微生物群耗竭的小鼠，促进γδ+T细胞产生IL-17A。重要的是，研究人员通过从LPS和弹性蛋白酶处理的小鼠身上转移丰富的微生物，同时与LPS和弹性蛋白酶共同挑战抗生素处理的小鼠(150)，重新表达了上调的IL-17A免疫表型。本实验证明肺微生物群在免疫表型上具有一定的功能作用，但该作用的个别成分仍需明确阐明。在本研究中，LPS和弹性蛋白酶的使用引起了类似于Poroyko及其同事的研究的问题，即诱导Th17表型所需的是活的复杂微生物群落还是病原体相关的分子模式(PAMPS)。此外，LPS可能会有不同的影响，取决于来源的生物体，通常是大肠杆菌，因此可能不是从常见的微生物在较低的气道(106，150)。鉴于下气道微生物群的复杂性，其他微生物产物也可能对下气道(106，150)的宿主免疫表型发挥重要作用。
Th17表型的存在和IL-17的上调对下气道的微生物群落有重要意义。下呼吸道微生物群不是无反应的乘客，而是刺激和减弱先天和适应性免疫反应的发展。在此，由类似上呼吸道微生物群的微生物群所定义的失调与亚临床的促炎表型(30)有关。复杂的代谢相互作用与这种微生物区系失衡有关。此外，也有证据表明，由一个独特的肺微生物群触发的反调节机制的激活。肺泡巨噬细胞收集自具有下气道微生物组特征的细菌，与TLR 4反应减弱有关，TNF-α、MDC、IL-6和GM-CSF在LPS刺激下产生减少(30)。这种减弱的天然免疫反应在这个独特的肺微微生物群因此可能是一个重要的抗调节机制，在肺泡巨噬细胞在肺粘膜需要减轻炎症免疫反应(3，30，145，147)。这与其他器官系统中发现的多种其他反调节机制相一致，包括胃肠道(3，145-147)。
Th17炎症通路和IL-17上调并不是唯一可能被上调的宿主肺功能失调的途径。Richmond和他的同事们的研究也证实了pIgR缺陷小鼠粘膜免疫功能的丧失导致微生物侵入上皮细胞(95)。相比之下，野生型小鼠和pIgR缺乏型小鼠气道腔内细菌的百分比并没有差异，这表明这种影响仅仅是由于微生物的入侵所致。pIgR缺乏症小鼠在BAL液(95)中也显示NF-κB通路与NF-κB依赖性的趋化因子(KC)有关。综合起来，这个小鼠的黏膜免疫缺陷模型是另一个途径的例子，它是由下气道内固有的微生物相互作用激活的，是一个研究的目标。
代谢产物和细菌代谢产物也将对肺微生物组具有免疫调节作用。慢性炎症是囊性纤维化对肺系统的影响的典型代表。炎症的机制主要是由典型的囊性纤维化微生物定植而来，但也有来自兼性厌氧菌的厌氧代谢，这些厌氧菌在微生物组分中所占的比例较小(90)。具有兼性厌氧代谢能力的微生物常在口腔中发现，并已在囊性纤维化患者的下气道中被发现。短链脂肪酸(SCFAs)是厌氧代谢的副产品，已被证明能改变和影响囊性纤维化(131)中的炎症。
肺粘膜表面是与外部世界的重要界面，它在清除微生物并对微生物作出反应的先天和适应性免疫反应中发挥作用，提供肺泡巨噬细胞(肺泡巨噬细胞)，这些巨噬细胞维持着从被调理的微生物中呈递抗原的重要作用，并具有调节信号细胞因子和趋化因子的能力(151)。上述数据表明，有多种证据支持下气道微生物体在维持下气道粘膜免疫张力方面的重要作用。这种反应可能是激发免疫系统所需的“健康”免疫音调的一部分，也可能在多种气道炎症性疾病的炎症过程中发挥重要作用。
微生物群的研究已经发现了一个复杂多样的微生物群落，居住在我们的体内。利用多组学，我们可以评估微生物和宿主之间的动态平衡。这种复杂的微生物群落与宿主免疫系统相互作用的新观点迫使我们重新考虑科赫关于疾病的经典假设。最大的挑战是如何认识到复杂的微生物群落可能在影响其微环境，包括宿主免疫反应(152)方面具有相互作用和积极作用。引起疾病的微生物群落的影响对科赫的假设提出了挑战，因为它们通常被用来理解单一微生物是如何导致疾病的。这些假设被用来将微生物归类为病原体(153)。在微生物群落与宿主相互作用并影响其环境的情况下，微生物及其群落的“致病”作用可能需要重新定义(154，155)。因此，可以从微生物与宿主的相互作用、受微生物自身毒力因子、相关微生物群和宿主免疫反应影响的界面来看待致病性。
目前，我们对许多肺部疾病的认识受到关联研究的限制，人类和小鼠模型中的功能研究尚未完成。这些不同的相互作用和机制可以通过对代谢组学、代谢组学、代谢组学、元蛋白质组学、病毒学和其他“组学”研究(22、23、30、155)进一步阐明。使用这些方法对于了解微生物群落如何影响健康和疾病以及把群落作为一个整体来看，对科赫假设的经典方法提出挑战将是非常重要的(155)。
结论
呼吸粘膜代表着人类宿主和环境之间的广泛和包罗万象的边界。胃肠道与呼吸道的差异，如微生物浓度、器官长度、取样方便性、生理参数的差异等，都是肺微生物研究中具有挑战性的细微差别。注意力已从了解呼吸道微生物群的生态组成转移到若干关键问题，包括：特定微生物群落的定植和持续存在、在特定群落存在时被上调和下调的炎症途径以及这些炎症途径的功能和机制原因(23、30)。
肺部通过不同的机制，如空气消化、反流和夜间微量吸入，可以看到多种微生物的挑战(38)。这些重复的微生物挑战可能在宿主免疫应答(23，30，156)中发挥重要作用。对宿主免疫状态的影响可能代表有益的免疫启动，或有助于疾病发展的致病免疫过程。
下呼吸道肺微生物群的未来发展方向将需要重点研究微生物群落功能，了解微生物与微生物之间的相互作用，建立揭示因果关系的实验模型。最终，我们的目标是寻找潜在的微生物靶点，以便更精确地操纵下气道微生物群，如精细使用抗生素、噬菌体疗法或针对特定微生物代谢途径的分子，以改变肺部疾病的自然过程。
