生物知识个人分享

博客迁移至自有服务器

Mon, 20 Aug 2018 00:00:00 +0000

不全是由于微软收购了github，但是github在国内的环境访问延迟太大了，即将迁移到自已的腾讯云香港区服务器，既能对全部互联网开放，又能兼顾速度，将于gcloud一年试用期到后迁移至腾讯云。现在正在寻找自己挂hexo服务器的方法。http://jiawen.zd200572.com（现在位于gcloud）欢迎访问来踩踩！

极客精神，持续学习，用心生活，加油！

QIIME2图形界面学习笔记

Wed, 23 May 2018 00:00:00 +0000

1.Feature表统计

继续我的qiime2图形界面q2studio学习笔记，之前已经获得了featuretable，现在对这个表做个统计。依旧是很简单的，选择featuretable–visualization-summarize table，这里是需要实验设计文件（metadata）的，最好放上，这里我就不放了。点run之后，很快就有结果了。

结果就像教程里的那样，

2.代表序列统计

这也没什么好说的，统计一下代表性的序列。使用feature taable里的view sequence associated with each feature选项，然后程序会自动载入数据，执行即可。

结果如图：

3.建树：用于多样性分析

3.1 多序列比对

alignment–de nova multiple alignment with mafft，中间不小心报错，原因不明，但显示已完成，先放这。

3.2 移除高变区

应该是这个alignment–Positional conservation and gap filtering.默认参数试试，因为命令行没有给出参数。

3.3 建树

phylogeny–construct a phylogenetic tree with FastTree

3.4 无根树转换为有根树

phylogeny–midpoint root an rooted phylogenetic tree

4.计算多样性(包括所有常用的Alpha和Beta多样性方法)，输入有根树、Feature表、样本重采样深度(一般为最小样本数据量，或覆盖绝大多数样品的数据量)

diversity–Core Diversity metrics(phylogeny and non phylogeny)

因为手头的数据不清楚实验分组情况，随便做了个metadata，只包含样本名称和分组信息的文件。

果然出现了报错：

/home/qiime2/miniconda/envs/qiime2-2018``.4``/lib/python3``.5``/site-packages/sklearn/utils/validation``.py:475: DataConversionWarning: Data with input dtype int64 was converted to bool by check_pairwise_arrays.``warnings.warn(msg, DataConversionWarning)

5.物种分类

5.1 物种注释

鉴于出现了错误，估计beta多样性也做不起来，那么就先看下特种注释，这个对我来说目前最有价值的数据。

下载注释所需文件：

https://data.qiime2.org/2018.4/common/gg-13-8-99-515-806-nb-classifier.qza

下载了个旧版本2017。6的文件报错不兼容，软件兼容性啊，也是醉了，于是下这个2018。4。

feature-classifier–classify-sklearn

5.2 物种分类柱状图

taxa–visualization–Visualize taxonomy with an interactive bar plot 是交互式的动态图哦！

当当当当，让人魂牵梦莹的图终于出现了，今天的学习先到这里。

https://jiawen.zd200572.com/343.html

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selenium模块报错的解决

Fri, 18 May 2018 00:00:00 +0000

selenium是一个控制浏览器的模块，66的，挺酷的感觉。我在《python编程快速上手–让繁琐工作自动化（Automate the Boring Stuff with Python）》中读到了这个模块，想试试，却发现问题是不管用哪个浏览器，都会报类似的错误：

selenium.common.exceptions.WebDriverException: Message: ‘geckodriver’ executable needs to be in PATH.

在网上搜了个解决方案是下载这个driver，然后把驱动所在路径放在PATH中（Windows），经过实践发现没有效果，于是继续查解决方案，终于在知乎上找到了：

https://www.zhihu.com/question/49568096

1、下载geckodriver.exe：

下载地址：https://github.com/mozilla/geckodriver/releases请根据系统版本选择下载；（如Windows 64位系统）

2、下载解压后将getckodriver.exe复制到Firefox的安装目录下，如（C:\Program Files\Mozilla Firefox），并在环境变量Path中添加路径：

C:\Program Files\Mozilla Firefox；重启cmd或IDLE再次运行代码即可**

然后，就可以愉快地玩耍了，继续学习啦！

我的云服务器在做哪些服务

Thu, 03 May 2018 00:00:00 +0000

1.LA(N)MP

这是最重要的嘛，做一个展示窗口，也就是现在看到的网站，wordpress傻瓜式建站，你也可以拥有。写个博客大概相当于QQ空间一样简单了。再加个插件变成app和小程序一样简单，开源的力量是伟大的，拥抱开源，拥抱技术。

2.Rstudio server

想要做点不是特别消耗硬件的任务，是一个不错的选择，这样还可以协作，或者在手机平板上随时随地运行，尽管体验比较差。内存如果不够的话建议不要尝试了，至少1G，还需要SWAP空间1g才刚刚好。

3.Ipython Notebook

这是数据科学家的最爱，一样可以随时随地写python，好像R也可以，像笔记本一样的，畅快无比，强烈推荐，这个对资源的要求不是那么高的，估计512M内存也可以运行了。当然如果运行多个任务还是加上swap，因为云服务器默认不开swap的。

4.phpmyadmin

严格来讲这个属于sql的图形化界面，应该属于LNMP的M，MySQL了，但是这里单独拉出来关凑个数。还可以用来监控资源使用情况，方便是方便，也带来了安全性的问题。

5.shadowsocks

用来学习国外知识的阶梯，这个不表。

6.其他

看知乎上其他大佬推荐的，挂机什么的，大概收不到多少钱，除非纯粹闲置，不建议使用。内网穿透、dns、smtp、gitlab、爬虫、小程充（app）后台、云存储大概也就这么多了。我还发现在腾讯良心云选择建站主机有香港的选项，大概是同等配置全世界最优惠的了，两年只要440，大概的vltr，banwgon之类的一个价了，还位置在香港，不限流量，gcloud的免费体验完了决定就迁移到那，妥妥地。

科研狗词云绘制代码注释

Thu, 26 Apr 2018 00:00:00 +0000

还是科研狗R绘图学习小组的内容，由于尝试加入没有成功，决定跟着学，因为他们在做一些有趣的实用的事情，即使收集代码，稍微改下就能直接使用，很有价值。

http://group.keyangou.com/RGraph

第二部分：R语言文本分析及数据分析应用

R语言访问Pubmed接口获得2016年CELL杂志发表文章数据

R语言将所获数据存储在mysql数据库

R语言读取mysql数据文件进行分词并存储

R语言绘制CELL词汇云

R语言对CELL词汇进行自定义分析

R语言中文分词

R语言获得5000本期刊近5年的影响因子以及绘图

R语言找出5000本期刊中影响因子上升最快前10名和下降最快前10名以及最稳定的前10名

#任务1
library(RMySQL)
#数据库连接删除函数，每个任务之前最好先清理所有的连接，调用此函数就可以
killDbConnections <- function () {
  all_cons <- dbListConnections(MySQL())
  print(all_cons)
  for(con in all_cons)
    +  dbDisconnect(con)
  print(paste(length(all_cons), " connections killed."))
}#依旧是那个可以清理与数据库链接的函数
killDbConnections()
#创建数据库连接  
con <- dbConnect(MySQL(),host="localhost",dbname="rdb2",user="root",password="")
dbSendQuery(con,'SET NAMES utf8')
rs <- dbSendQuery(con, "SELECT * FROM article WHERE isdone=1")#选中isdone=1的代码，估计就是有内容的。
#涉及到定义函数的学习得比较吃力了，没有相关经验，努力学习呀！
words = data.frame(word=c(), freq = c())#创建一个数据框
while (!dbHasCompleted(rs)) {
  chunk <- dbFetch(rs, 10)
  #chunk[,4]为title, #chunk[,5]为abstract
  count=nrow(chunk)
  cnt=1
  while(cnt<=count){
    str = gsub("[[:punct:]]", "", tolower(chunk[cnt,5])) 
    temp = as.vector(unlist(strsplit(str, split = " ")))
    temp_len = length(temp)
    cnt2 = 1
    while(cnt2 <= temp_len){
if(temp[cnt2] %in% words$word){
    words[words$word == temp[cnt2],]$freq = words[words$word == temp[cnt2],]$freq+1
      }
else{
        words = rbind(words,data.frame(word=c(temp[cnt2]),freq=c(1)))
      }
      cnt2 = cnt2+1
    }
    cnt = cnt +1
  }
}
head(words)
  
  
#任务2
library(wordcloud2)
wordcloud2(words[0:1000,]) 
  
#任务3
#按照freq的降序排列
new_words = words[order(words$freq,decreasing=T),]
#去掉一些定冠词等 of and the
del_word = c('not','two','other','during','of','it','may','the','and','in','to','a','that','is','for','by','with','we','are','an','this','these','as','from','which','at','their','have','or','our','its','but','how','be','as','here','on','can','into','data','between','both','also')
words2 =words[which(!(words$word %in% del_word)),]
wordcloud2(words2)#这个包用法很easy嘛，直接调用就好。

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mongodb安装笔记（windows、Mac 10.9和linux）

Mon, 19 Mar 2018 00:00:00 +0000

由于拥有好几台电脑，折腾便成了我的乐趣，从windows，Mac OSX 10.9到10.10、10.11，linux deepin 15.4，kali,以及树阿莓派的raspbian，服务器的ubuntu server都是我的折腾对象，这也部分反应了物欲横流的我啊！但是这样也多了解了点不同操作系统的差异，可专注性还是不好啊！看到每个论坛的资深发烧友都有收藏癖，像51专门网的大哥们每个人人手几台thinkpad小黑，chromebook群里有人几台chromebook，资深果粉逢出必买，数码之家的网友一堆电子古董，486什么的各种收藏，龙芯吧的小伙伴们拥有好几台龙芯，电纸书爱好者的好几个电纸书。。。说了这么多，我好像暴露了好多信息。

下面是我的mongodb折腾经验，linux操作系统，比较简单，一般都已经编译好的包，直接apt install mongodb或者yum 什么的，连树莓派都可以这样搞定，只不过版本偏低，想追求高的，添加mongodb软件源即可。

mac操作系统，10.11的，上面已经说过了，用mongodb去装个低版本的，至于古董级别的，就从官网下个这个系统那个时间的版本，不得不吐槽，mac的系统兼容性实在太差，注定难以成为一个大众的操作系统，不能成为生产中可靠的依赖。

win版本也比较简单，只不过解压然后添加环境变量就好了，或者是使用安装版本。

至于开机启动，win是把它注册为服务，linux是添加rc.d，mac是添加plist。针对于gui管理工具的使用，如果本地使用没问题，如果是像我一样云服务器使用，就要修改/etc/mongodb/config.conf中的bind的ip为你的ip或者0.0.0.0即可，好像这样有点不安全的。

一直好奇，这是不是应该叫芒果数据库，听着好好玩，文档数据库。

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细菌微生物组在肺病中的作用

Fri, 02 Mar 2018 00:00:00 +0000

原文来自:Dickson R P, Erb-Downward J R, Huffnagle G B. The role of the bacterial microbiome in lung disease[J]. Expert Review of Respiratory Medicine, 2013, 7(3):245.

摘要

新的不依赖于培养的技术最近已经证明，在健康中，被认为是无菌的下呼吸道，含有多种微生物群落：肺微生物群。越来越多的文献表明，在健康和各种呼吸道疾病中都存在着一种独特的下呼吸道微生物，尽管这些发现的生物学和临床意义仍未确定。本文综述了已发表的健康和疾病患者肺微生物区系、微生物多样性和疾病构成的研究报告，并展望了肺外微生物群的假说和未来研究方向。

简介

虽然肺部在历史上被认为是健康无菌的，最初被排除在人类微生物组项目(HMP)的优先器官系统清单之外，但随后的研究表明，下呼吸道充满了健康和疾病状态下的各种细菌群落。尽管肺外微生物群的研究起步较晚，但其研究领域正在迅速发展，并就肺微生物群与呼吸道疾病之间的关系发表了挑衅性的观察结果(图1)。对肺部微生物群的研究可能会为肺部感染的发病机制提供新的见解和途径，肺部感染一直是世界范围内疾病负担的主要原因[1]，以及以前认为仅与微生物发病机制有间接关系的各种肺部疾病的发病机制。在过去的十年中，新的不依赖于培养的微生物鉴定技术已经在我们对人体内和体内微生物细胞的丰富和多样性的理解上得到了扩展，这些细胞统称为微生物群。一个人拥有超过一万亿个细菌细胞，而一个人的微生物群中的基因数量是他/她的100[2]倍。常驻细菌在营养吸收、维生素合成、异物代谢、免疫调节、微生物紊乱等方面起着重要的作用，与感染、自身免疫、肥胖、心血管疾病和恶性肿瘤有关[3]。2008，国家卫生研究所认识到微生物组群在人类健康中的重要性，启动了HMP，以确定人体和人体内细菌群落的特征，并探讨其对健康和疾病的影响。本文将讨论我们目前对以下几个方面的认识：(一)分析微生物群的方法，(二)健康肺的微生物群，(三)特定情况下的病肺微生物群，(四)疾病状态下观察到的肺微生物群的一般主题，以及(五)肺外微生物体研究的经验教训、启示和假设。

I.肺微生物群分析方法

现代分子微生物检测技术的研究从未证实过健康个体下呼吸道的无菌性。传统的观点认为健康的肺是无菌的，这是从130年的定义，即从组织样本上细菌在培养基上生长的能力。在肺炎等传染病状态中，细菌病原体或辅助因素甚至难以找到，在这些疾病中，75%的确诊病人没有发现病原体。考虑到人体内70%的细菌不能用标准的医学微生物学培养基[5]培养，这些临床观察仅说明我们对健康和疾病期间肺部宿主微生物相互作用的理解不足。许多现代细菌鉴定分子技术利用16 SrRNA基因的变异，这是细菌基因组中一个小而高度保守的位点，允许进行基因和物种水平的鉴定。高通量测序16S rRNA基因扩增产生的细菌生物样品产生大量的短序列，随后可以对和排序根据预定义的水平的同源性。然后根据公开可得的分类数据库[6，7]对这些数据进行分类。利用这些原则，454焦测序和illumina测序等平台能够同时识别和量化多个组织样本中的整个微生物群落[8]。(图2)这些敏感和快速的技术，往往比传统的文化相关方法更彻底和准确，在过去十年中，效率大大提高，成本降低。目前，大多数肺微生物学研究都集中在肺内细菌群落的构成上，类似的技术可以用来描述病毒和真菌生物。病毒和真菌在急慢性呼吸道疾病的发病机制中都可能具有相当重要的作用，但迄今为止关于这一课题的文献还很有限，超出了本文的研究范围。靶向PCR技术已广泛应用于呼吸道病毒和肺孢子虫的临床诊断。到目前为止，大多数肺微生物分析都是在支气管肺泡灌洗(BAL)液上进行的，或者在囊性纤维化的情况下，是在自发性痰中进行的。上气道微生物群对痰或BAL标本中微生物含量的准确贡献是一个有争议的问题。通过无菌外科外植体获得的肺组织的分析研究已经完成，所有的研究都表明下呼吸道包含一个不同于但与上气道相关的微生物群[9-12]。有人提出了一种上呼吸道微生物(经支气管镜污染或围术期微抽吸)的方法，即通过对上呼吸道标本[13，14]信号的去除，但这种方法既未得到验证，也未得到普遍采用。一些研究人员建议采用中立生物多样性理论[15，16]，以评估下呼吸道中检测到的微生物是否是上呼吸道微生物群的直接延伸(在这种情况下，其相对浓度应反映上气道微生物群)，或下呼吸道因素中的选择性压力是否有利于特定物种的相对丰度[17]。在这一概念框架内，“无效假设”是，没有独特的选择压力作用于细菌繁殖在下呼吸道，在这种情况下，细菌在BAL标本中的相对浓度应该与上呼吸道的细菌的浓度相当。BAL中大量存在的物种的存在将否定零假设(并且不符合“中性模型”)，这意味着在下气道细菌物种有一个独特的生态位。在这些问题得到解决之前，不可能准确地比较下呼吸道和身体其他部分之间的细菌生物量，但肺泡和小气道中细菌的浓度可能大大低于口或下消化道的细菌浓度，最多可与胃或小肠的细菌浓度相比[18]。这些低绝对水平的细菌生物量给该领域带来了特殊的挑战，即上呼吸道出现假阳性信号的风险，以及试剂或实验室环境中出现的低水平信号的意外放大。为了解决这一问题，最近的研究不仅包括上呼吸道生物样本，还包括支气管镜冲洗和试剂对照。上述鉴定细菌的分子技术的一个重要方面通常不会在本质上区分死细菌和活细菌，而只是鉴定分析样本中是否存在dna。这与传统的依赖于文化的技术不同，后者需要有活的有机体。这是这些新技术应被视为对传统微生物鉴定方法的补充，而不是替代方法的一个方面。

II. 健康肺的微生物群

胎儿的肺，就像胎儿的肠子一样，被认为是无菌的，婴儿的肺很可能在出生后获得微生物群落。在分娩后即刻，婴儿粘膜表面迅速被来自母亲的微生物所填充(阴道分娩时的阴道和肠道微生物，Cesaerean切片中的皮肤微生物)[19]。婴儿微生物群最初在不同的体位上是一致的，在随后的几天和几周内被区分为特定地点的群落[20]。健康婴儿肺微生物群的来源尚未研究，但最近对7例囊性纤维化婴儿的纵向研究显示肠道微生物群落与呼吸道微生物群落之间的一致性，证明胃肠道的时间优先[21]。许多已发表的研究表明，使用BAL样本[9，13，14，18，22-24]健康成人的肺微生物群。当分析门的相对丰度时，一致观察到的最常见的门是：Bacteroides, Firmicutes 和Proteobacteria。BAL标本中描述的门与同期采集的上呼吸道(口咽、鼻)标本相似，但相对丰度不同(例如，放线杆菌的相对频率)。健康对照组中的优势属为Prevotella, Veillonella, Streptococcus和Pseudomon。主动吸烟似乎改变了上气道的微生物组成[25]；其对肺微生物群的影响尚不清楚。在比较英国和美国的标本[26]时，观察了囊性纤维化患者痰微生物区系的差异，并报道了不同地理来源的人肠道微生物群有很大的地域差异[27]，但生物地理对正常肺微生物群构成的影响还没有描述。 描述对照病人肺部微生物群的研究由于样本量小和缺乏纵向研究而受到限制；截至2012年底，发表的研究中的对照对象总数为75人[9、13、14、18、22-24]，而来自同一对照者的系列标本尚未报告。肺HIV微生物组项目(LHMP)是一个正在进行的、多中心的NIH项目，旨在补充HMP，目的是通过在多个时间点研究许多没有已知肺病理学的患者的肺部微生物群来解决这个问题。

III. 疾病肺的微生物群

a.囊性纤维化-自20世纪30年代首次描述以来，囊性纤维化(CF)一直与反复呼吸道感染[28]有关，而这种系统性疾病的发病和死亡的主要原因仍然是进行性气道阻塞和相关呼吸道感染[29，30]。用培养技术检测的常见病原体包括金黄色葡萄球菌、流感嗜血杆菌和随年龄增长的铜绿假单胞菌。间歇性和最初(表面上)可根除的感染之后是培养可检测的气道定植，患者容易感染其他罕见的呼吸道病原体，如嗜麦芽窄食单胞菌和盲肠吸虫复合体(Burkholderia Cepacia)。近十年来，非培养微生物鉴定技术一直被用来表征CF患者的气道微生物群，而CF的肺微生物群的报道比所有其他呼吸道疾病加起来的结果都要全面[10，23，26，31-58]。应用了多种分子技术，包括末端限制性片段长度多态性分析[23，26，31-35，39，44，47，49，57]，克隆文库测序[31，32，36，38，42，45，46]，焦测序[10，42，47，48，50-52，58]，生理芯片[43]和光照[55]技术。大多数研究都是针对自然祛痰样本进行的，很少使用BAL[31，35]和肺组织[10，23，46，48，54，56]。这些引文清单并不全面，并且强调了试图描述下气道微生物群落特征的研究。分子方法揭示了CF气道微生物区系以前未被认识到的复杂性，无论是在活动恶化期间还是在活动恶化之间。罗杰斯等人早期重要的观察发现，活动性细菌性呼吸道感染患者的痰中含有大量的多种细菌[32，33，44]。随后的研究再次证明了气道定植和感染在CF中的多微生物特性，包括许多以前通过培养依赖技术而未被识别的物种。这一发现可能部分解释了长期观察到的痰培养、形态和敏感性结果与患者对抗菌药物治疗的反应之间的不一致[59]。这一观察对急性和慢性使用抗生素治疗的临床意义尚不清楚，但它表明，与其“清除”感染，相反，使用抗生素改变了动态和异质微生物群落的内部结构。一项单一的研究发现非CF型支气管扩张症患者肺部的复杂性相当[54]，但尚未确定这些发现是否普遍适用于其他形式的肺部感染。对CF肺微生物群的研究已经发现了许多以前未被承认的细菌，这些细菌在CF恶化、炎症和气道破坏中具有潜在的致病性。对厌氧物种[32-34]产生了特别的兴趣，其共同的存在和生存能力随后通过培养依赖技术得到证实[60]。目前还没有发表的临床试验，无论是前瞻性的还是其他的，研究了针对这些微生物的靶向抗生素治疗是否有益，其临床意义尚未确定。 有几项研究已经研究了肺微生物群的多样性是否随病情的时间或严重程度而变化。Cox等人采用纵向分析的方法证明，随着气道阻塞的年龄和严重程度，细菌群落多样性降低；同一研究发现，纯合子ΔF 508突变的患者与异种-ΔF 508患者和非ΔF 508患者相比，微生物多样性降低[40]。Klepac-Ceraj等人还发现，随着年龄的增长，微生物多样性逐渐减少，并证实了全身和吸入抗生素对多样性的负面影响[43]。在迄今公布的最大和最长期的CF气道样本中，赵等人显示，随着时间的推移，多样性逐渐减少，但在轻度气道疾病患者中相对稳定[58]。在这个系列中，最近抗生素的使用是微生物多样性下降的最有力的预测因子。Stressmann et也观察了抗生素治疗对肺微生物学的直接影响。他观察到抗生素前的群落结构似乎在抗生素暴露后一个月内恢复到显著水平[57]。最近，一项研究比较了对重症晚期CF患者的移植肺组织、咽喉和痰标本进行的独立培养分析，发现痰祛痰准确地代表了相对均一的下呼吸道中的优势微生物，但夸大了非典型细菌种类的多样性和代表性[10]。大多数下呼吸道样本绝大多数由一至三种典型呼吸道病原体组成。作者提出了“减去”上呼吸道微生物群的方法。两个临床试验已经检查肠道益生菌是否影响CF患者肺恶化的频率和严重程度[61，62]。这些研究虽然规模较小，但都发现与对照组服用安慰剂[61]相比，肺部恶化的频率显著降低，与益生菌治疗前后的研究对象相比[62]。这些发现必须在更大的试验中验证，然后才能推荐常规的临床使用，但它们对疗效的机制提出了挑衅性的问题。这两项研究的作者都推测，减少肠道壁炎症对肺部炎症的间接影响可能会产生益处，但目前尚不清楚肠内益生菌如何影响肺微生物的组成。 b.哮喘和变态反应气道疾病–儿童感染频率的降低与哮喘和过敏的发展增加之间的联系多年来一直被人们认识到，这就产生了“卫生假说”：早期感染的减少会导致粘膜耐受性紊乱和自身免疫病的增加[63]。多项研究发现，儿童早期抗生素暴露与哮喘和过敏的后续发展之间存在关联[63，64]，推测正常微生物群的破坏可能与这些疾病的发病机制有关。两项重要的研究已经研究了哮喘患者与健康对照者肺微生物组的组成[18，24]。[18]Hilty等人比较了哮喘患者口腔、鼻腔和BAL标本与慢性阻塞性肺疾病患者和健康对照者的微生物群[18]。在哮喘患者中，作者发现与对照组相比，蛋白质杆菌的频率增加，Bacteroidetes细菌的频率降低。这种相对增加的Proteobacteriae细菌是由Haemophilus, Moraxella和Neisseria 导致的。随后，Huang等人将65例控制不良的哮喘患者的肺微生物(用保护标本刷获得的支气管微生物)与10名对照组进行了比较，发现哮喘患者的细菌负担和细菌多样性均有所增加[24]。他们证实了哮喘患者中Proteobacteriae细菌相对丰度的增加，并发现多种细菌的存在与支气管高反应性的严重程度呈正相关。当使用克拉霉素时，在支气管高反应性患者中发现了更大的多样性，这是在肺微生物群构成与临床干预的功能反应之间的罕见观察之一。除了肺部微生物群在气道过敏性疾病中可能发挥的作用外，一个互补的假设是，由于抗生素的使用和西方地区的低纤维、高糖饮食而引起的胃肠微生物群组成的紊乱已经破坏了胃肠道微生物体介导的粘膜耐受机制。支持这一假说的数据包括工业化国家[65-69]哮喘/过敏与抗生素使用之间的相关性，以及粪便微生物群改变与特应性疾病之间的相关性[70-76]。在抗生素治疗和无菌小鼠中对这一假说的直接测试支持了肠道微生物群的变化与肺部过敏反应之间的这种潜在联系[77-79]。一些研究实验了乳酸菌口服给药对实验性过敏性肺部炎症的调节作用。 c.慢性阻塞性肺疾病-自早期现代描述以来，慢性阻塞性肺疾病(COPD)被推测至少是由慢性和反复呼吸道感染引起的炎症引起的[80]。然而，呼吸道破坏与呼吸道定植/感染之间的因果关系方向仍然不确定，尽管已有几十年的积极研究[81，82]。最近的一项试验显示慢性阿奇霉素对慢性阻塞性肺病(COPD)频繁加重的患者有好处，引起了人们对肺/气道微生物区系交叉、炎症和不可逆气道阻塞的重新兴趣[83]。在过去四年中，有七项研究报告了COPD患者的肺微生物群[9，12，18，22，23，39，84]。除一名患者外，所有患者没有呼吸道感染的积极证据和最近没有使用抗生素，用于分析的样本包括BAL[9，12，18，22]，移植的肺组织和痰排痰[39]。这些研究表明，COPD患者的下气道和肺泡中含有明显的微生物群，这可能与疾病的慢性进展和感染性恶化的间歇性发展有关。 Hilty等人对哮喘患者微生物群的早期研究包括5例COPD患者[18]。COPD患者标本的微生物区系与哮喘患者相一致，并与健康对照者不同，蛋白质细菌的相对存在量相似地增加，类杆菌的数量也相对减少。值得注意的是，与对照组相比，COPD标本中含有更多的嗜血杆菌，这是COPD加重期最常见的培养生物。在随后的一项研究中，Erb-down等人比较了在BAL和移植肺组织中发现的严重COPD患者与没有肺病或阻塞性通气功能障碍的吸烟者和非吸烟对照者的肺组织[9]。他们发现，16 SrRNA基因在他们的群体中的浓度是相当的，这就意味着他们的细菌负担是相当的。气道阻塞最严重的受试者微生物多样性明显降低，在属级成员中存在广泛的重叠现象。COPD标本中常见的属为假单胞菌属、链球菌属、Prevotella属和嗜血杆菌属。作者分析了同一肺内多个部位的组织(来自移植受者移植的本地肺)，揭示了严重疾病患者肺内(甚至单个肺叶)内肺微生物的明显区域异质性。 Sze等人还对手术获得的肺组织标本进行了研究。[23]他发现COPD肺组织中细菌细胞数量较少，与对照组相比，差异无显著性。COPD患者和对照组的多样性明显大于分析中的CF患者。与吸烟和非吸烟对照相比，COPD患者中发现了一种明显的微生物群，蛋白质细菌和类杆菌的丰度相当，但与对照组相比，厚壁菌微生物数量增加。乳酸菌属的增加推动了厚壁菌的增加。本研究与其他研究的一个重要区别是，分析的组织大部分可能是肺泡实体，而气道包涵体相对较少，这可能解释了所发现的相对丰度的一些差异。 Cabrera-Rubio等人通过对8例COPD患者痰痰标本、支气管吸入液标本、BAL标本和支气管粘膜活检标本的分析，研究了8例COPD患者的呼吸微生物群[12]。他们观察到与以前的研究(蛋白质细菌、细菌、放线杆菌和第一菌)相同的门，其中链球菌、Prevotella、Moraxella、嗜血杆菌、不动杆菌、镰刀菌和奈瑟菌在这些属中占很大比例。他们发现BAL中的微生物区系与支气管粘膜标本具有一致性，但随着类杆菌和厚壁菌的频率的增加，上呼吸道标本(支气管吸痰和祛痰)的微生物多样性降低。 Pragman等人用焦测序法比较了22例COPD患者和10例对照组BAL的微生物区系，发现COPD患者的微生物多样性增加，且与梗阻程度呈正相关。COPD和对照标本中最常见的门是放线菌、纤支杆菌和蛋白杆菌。这项研究的一个重要贡献是认识到BAL样本的微生物区系不仅与疾病状况有关，而且还与吸入支气管扩张剂和/或吸入皮质类固醇有关。这一观察，结合吸入糖皮质激素与严重肺炎发生率增加有关的临床观察[85]，应有助于进一步研究吸入药物对肺微生物区系的影响。一项单一的研究探索了COPD患者急性加重期呼吸标本的微生物区系[84]。Huang等人研究了8名因COPD加重而导致呼吸衰竭的机械通气患者。与其他COPD研究的对象不同，这些患者都是在样本采集之前接受了最近的抗生素治疗。尽管如此，在分析的气管内吸气液中发现了令人印象深刻的微生物多样性。机械通气时间对所鉴定的微生物区系构成有影响，作者鉴定了所有标本中有75个细菌类群和27个细菌科的“核心”，包括假单胞菌科、肠杆菌科、弯曲杆菌科和螺旋杆菌科。本研究的一个重要参数是，受试者来自于呼吸道标本中培养的铜绿假单胞菌的大量插管患者。 d.肺移植-肺移植受者的死亡率和移植物功能障碍仍然高于所有其他实体器官移植的死亡率和移植物功能障碍，大多数发病率可归因于感染或毛细支气管炎闭塞症(BO)和毛细支气管炎闭塞综合征(BOS)：小气道慢性纤维增生，导致进行性、不可逆转的气道阻塞。虽然发病机制尚不清楚，但微生物感染/定植与BOS之间存在多种关联[86-88]。肺移植会导致呼吸道宿主防御系统发生许多变化，从而改变肺部的微生物区系，包括气道结构的扭曲、本土淋巴通道的中断以及抗排斥药物的全身免疫抑制。 Charlson等人最近发表了一项研究，将来自23例肺移植受者的BAL标本的微生物群与6名非移植对照组的样本进行了比较[89]。他们发现移植受者的微生物多样性下降，在一些情况下，单一物种(如铜绿假单胞菌和金黄色葡萄球菌)的存在非常普遍。在这些情况下，通常在常规培养中也能发现优势菌的特征。作者还对移植受者BAL中真菌种类进行了分析，发现有丰富的念珠菌和曲霉菌种。微生物组群组成与临床特征如急性或慢性排斥反应之间的重要联系尚未报道，目前仍不清楚。Borewicz等人随后的一份报告发现，与两个对照组相比，移植受者之间的多样性有所增加，移植门以蛋白质细菌门的Burkholderaceae科为主[90]。这一家族在任何一个对照标本中都没有被发现。在BOS发生前后，作者没有发现微生物群的明显聚集。 e.特发性间质性肺炎-一项单一的研究描述了特发性间质性肺炎患者的微生物群[91]，这是一种慢性弥漫性肺部疾病的异质性类型。用变性梯度凝胶电泳等方法对20例肺间质性疾病(特发性肺纤维化、非特异性间质性肺炎和急性间质性肺炎)患者BAL中的微生物群落进行了分析。两种典型的呼吸道病原体(如流感嗜血杆菌)和各种以前未被识别或未被识别的生物体都已被确认。挑衅性地观察到肺孢子虫的存在与细菌负担之间存在负关联，提示肺孢子虫与细菌之间可能存在体内拮抗作用。 机械通气-除了上述黄等人关于慢性阻塞性肺病加重期的研究[84]外，弗拉纳根等人仅有一份报告描述了机械通气患者呼吸标本的微生物群[92]。在Huang研究中，根据呼吸培养中是否存在机械通气和铜绿假单胞菌的情况，选择了入选患者，限制了所有通气患者的通用性。作者注意到在使用广谱抗生素期间呼吸微生物的多样性明显下降，通常伴随着优势生物的重组(通常是铜绿假单胞菌，尽管同时使用抗假单胞抗生素)。进一步的纵向分析可能有助于揭示抗生素和其他急性干预措施对肺部动态微生物群落的影响。

IV.呼吸系统疾病的一般主题

a.时间和空间的异质性-至今还没有发表的研究描述了健康对照的一系列呼吸道标本的纵向分析，因此“正常”肺微生物体的相对稳定性或动态性质尚不清楚。到目前为止，对肺部微生物标本的纵向分析几乎都是对CF患者的痰标本进行的[40，49，50，52，57，58]，这可能不能准确地反映他们下气道的微生物区系[10]。在发表的纵向研究中，个别病人痰中的微生物群落随着时间的推移相对稳定，尽管出现临床恶化和抗生素的使用[52，58]。由于痰分析的局限性和CF独特的临床特征，从这些观察中推断出任何关于健康和其他呼吸道疾病中微生物群稳定性的结论还为时过早。如上所述，正在进行的LHMP将包括非疾病患者的连续取样，并应提供更多关于肺微生物学的时间稳定性/动态的信息。然而，肺环境连续采样的深度/精度(与连续粪便采集肠道环境的连续采样相比)将始终是一个问题，除非未来的技术进步允许反复对下气道进行无创微生物群分析。在考虑微生物群落空间变异的两项研究中，严重COPD[9]和重度CF[48]的空间异质性显著。目前还不清楚这一发现是否是特定于这两种疾病的末期，这两种疾病的特征都是局部粘膜间隙受损，或者其他疾病的肺部在空间上是异型的。对上呼吸道和下呼吸道同时取样的样本进行比较的研究发现，上呼吸道标本中拟杆菌和叶放线菌的相对丰度增加，但微生物群落相似，但有明显区别。这些结果表明，呼吸道并不像传统上讨论的那样，是由离散和独立的间隔组成的。一个更精确的模型是，呼吸道是一个单一但内部异质的生态系统，从鼻翼延伸到肺泡，其中包含一个连续的、不断变化的微生物地形。来自上气道的微生物很可能通过直接的粘膜延伸和睡眠时的微吸入不断地进入下气道，这是普遍存在的，通常是无症状的[93]。来自下气道的微生物通过纤毛运输和咳嗽不断进入上气道，即使在没有呼吸道症状的患者中，这种情况每天也会发生多次[94，95]。呼吸道特定部位微生物群落的组成可能是这些影响以及温度、氧分压、pH、营养密度、局部宿主防御和种内及种间小分子信号等生长条件的综合作用。 b.疾病的多样性和严重程度–微生物多样性与呼吸道疾病的存在和严重程度之间的明确趋势迄今尚未在发表的研究中出现。在慢性阻塞性肺病(COPD)中，据报道肺微生物群的多样性与对照组相比增加[22]、减少[9]和相应的[23]。对肺移植受者BAL样本进行的类似分析发现，[90]增加了和减少了[89]多样性。这些相互矛盾的结果表明，单个受试者肺微生物群的多样性可能是多因素的，不能被解释为其疾病严重程度的一个简单功能。在某些疾病状态中，使用抗生素[43，58，92]，年龄[40，43]和CF基因型[40]影响多样性。进一步的研究，特别是纵向取样，有望发现其他多样性的驱动因素，并揭示其临床意义。 c.新病原体的鉴定–肺部微生物群研究的一个直接和短期目标是应用分子技术，通过培养技术来识别以前不被或过度重视的呼吸道病原体。我们对“病原体”、“污染物”和其他已鉴定的微生物之间的区别有了进一步的了解，这包括：1)新认识健康肺中的常驻细菌；2)在活动性感染状态下，识别与已知病原体同时存在的病原体；3)缺乏机械动物模型；4)缺乏纵向数据或临床试验。根据环境的不同，一个特定的微生物可能与其宿主有着完全不同的关系：在健康的稳态中，宿主与微生物的相互作用可能是互利的或中性的，但当稳态被破坏，微生物超越其生态位并通过毒力因子或通过激活宿主免疫间接造成组织损伤时，则是致病性的。仅是对活动性感染患者肺部微生物DNA的鉴定，仅仅是我们对肺部感染发病机制的认识的第一步。考虑到这些注意事项，并承认大多数上述回顾性研究排除了有活动性感染的患者，一些研究已经在有临床感染证据的患者的呼吸道标本中确定了大量可能未被识别的呼吸道病原体的浓度。其中大部分是在囊性纤维化文献[35，36]中收集的，其中收集到的大部分痰要么是活动恶化的背景，要么是病人与已知的致病微生物“定居”后收集的痰。新的候选病原体包括利索杆菌、立克次体、利莫苏斯、肺孢子虫和猪链球菌等。特别是厌氧菌，如Prevotella和Veillonella属，其共同存在已通过培养技术[60，96]，已确定这些微生物的浓度相当于铜绿假单胞菌和金黄色葡萄球菌的浓度。如上所述，这些发现必须被理解为可能受到上呼吸道污染的限制[10]，迄今为止还没有发表临床试验来检查治疗这些潜在病原体的有效性。在少数几项非CF研究中，包括有临床证据表明有活动性感染的患者，非培养技术证实了由基于培养的技术检测的物种占肺微生物群主要成分[92]，但同时存在许多其他具有不确定意义的生物体[84]。鉴于上述关于慢性肺病患者和非慢性肺病患者在未主动感染时肺微生物构成差异的观察，我们对“病原体”定义的理解可能需要修订和扩展。

V. 肺外微生物群研究的经验教训、意义和假设

肺微生物学研究领域对其他器官系统微生物区系的研究具有并行性和类比性的优点，其中许多器官系统在人体、种群和动物模型水平上已经被研究多年。对肺外微生物群的研究结果进行了综述，揭示了肺微生物学研究的潜在方向。 a. 修正简单化和过时的定义—肠道、皮肤和泌尿生殖道微生物群落的调查人员已不再将所有常驻微生物简单地称为共生微生物(从宿主或向其提供益处)或病原体。我们对幽门螺杆菌的理解是一项信息丰富的案例研究：虽然胃曾经被认为是无菌的(如肺)，但在许多受试者中(通过改进的诊断技术)显示胃含有大量的幽门螺杆菌，与消化性溃疡病和胃恶性肿瘤的发展有很强的关联[97]。然而，随后的研究揭示了幽门螺杆菌(Hp)与食管反流[98]和哮喘[99]之间的显著负相关关系，以及根除幽门螺杆菌与肥胖之间的机械联系[100]。这种生物最准确地被认为是一种“两栖动物”，一种与宿主有关系的常驻微生物，视环境而定，可被认为是共生的或致病性的[3]。目前尚不清楚这种“两栖动物”是否属于肺微生物学中描述的物种，以及哪些局部和系统因素可能影响它们与宿主关系的性质。除了完善我们对个体微生物命名的理解之外，对微生物群的研究还应该促使我们重新审视我们对什么是传统意义上的“感染”、“定植”和“健康”(即传统理解中的下呼吸道无菌)的理解。这些术语显然不足以解释迄今为止肺微生物群的发现。一种更好的理解将主动感染和“健康”肺微生物群的多样性置于一个连续体的两端，在不同程度的“失调”中分离出来，如细菌性阴道病和炎症性肠病。该模型将主动感染(如细菌性肺炎)理解为“正常”肺微生物群复杂的稳态破坏的一种紧急现象，而不是以前无菌室中侵入性有机体的不受抑制的生长。要全面描述肺部感染，就需要了解宿主肺部微生物群的组成及其抗扰动能力，这是科赫的假设[101]传统中缺失的一种元素。 b.“肺型”–近年来，人们一直致力于定义在人类肠道中联合在一起的细菌群落，它们是肠道微生物区系的特征“指纹”：“肠型”。在2011年的一项重要研究中，Arumagam等人描述了三种不同的肠道微生物群，它们的组成不同，地理位置不特定[102]；随后的一项研究表明，肠道肠型可能受饮食的影响[103]。肠型的临床意义尚不确定，Arumagam等人随后的分析表明肠道微生物群在不同的肠道类型中存在较多，而在不同的肠型中则较少[104]。但是，在随后的研究(特别是LHMP)中，一个重要而容易回答的问题是肺微生物群中是否存在类似的“肺型”，以及它们是否有助于进一步“表型”复杂和异质性疾病，如COPD。 c.肺内宿主微生物与微生物相互作用的机制–对人类肠道微生物群和动物模型的研究表明，微生物影响宿主炎症和微生物耐受性、宿主营养和药物代谢的机制以及微生物群落相互沟通和相互影响的方式，发现了许多发现。肠道微生物群与粘膜免疫的界面是动态的双向通讯。宿主免疫介质包括粘液层等物理屏障、上皮细胞分泌抗菌肽和产生微生物特异性IgA的复杂细胞免疫；反之，肠道微生物通过内毒素信号介导淋巴成熟、介导上皮修复、影响Th1/Th2平衡，并能促进本地微生物的粘膜耐受性[105]。大多数这些相互作用都是通过目前描述良好的小鼠肠道微生物群模型得到澄清的；由于在肺微生物学研究领域缺乏类似的模型，因此排除了对肺微生物区系的任何这样的观察。然而，我们已经观察到，小鼠肠道微生物群的紊乱会影响过敏性气道疾病的易感性[106]；这在多大程度上是全身免疫改变的结果，而不是GI和肺微生物群之间更直接的相互作用。最近的研究还揭示了细菌和宿主通过类似人类激素的小分子进行交流的多种机制，并影响细菌群体感应、宿主上皮细胞基因的表达和微生物毒力因子的激活[107]。长期以来，人们都知道许多微生物分泌抗菌肽；事实上，我们临床上可用的大多数抗生素最初都来自于细菌或真菌生物。这些观察表明，要全面了解肺微生物学体，就需要对微生物与微生物的相互作用进行研究，有可能作为上述“肺型”的中介。 d.微生物群对未发病人群的影响-微生物群紊乱与大肠癌[108109]和类风湿关节炎[110]之间的关系，以及一些可能的致病机制，都被描述为与微生物无典型性相关。到目前为止，还没有发表的研究对原发性肺癌或自身免疫性肺病患者的肺微生物群进行了研究。由于我们才刚刚开始了解疾病状态对微生物群的影响，因此肺微生物群不应被认为与任何疾病状态都无关，尽管它与我们对微生物发病机制的传统认识有着间接的联系。 ** e. 微生物学作为治疗目标-如果一个紊乱的肺微生物群被证明参与了疾病的发病过程(而不是偶然和次要的精神错乱)，它将作为一种新的治疗干预靶点而引起人们的关注。肺微生物群，就像其他组分一样，有可能被操纵，目的是通过使用益生菌(为了健康而使用的外部微生物)、前生物制剂(促进特定细菌生长的非吸收分子)、抗生素和群体感应分子抑制剂来纠正失调和恢复“健康”微生物群落。迄今为止，研究口服益生菌在胃肠道疾病中应用的临床试验在预防抗生素相关性腹泻[111]和治疗急性感染性腹泻[112]方面最为有力；对于难治性抗生素难治性难治性感染患者，肠道微生物群移植已显示出治愈的巨大希望[113]。这些表明，在肺部疾病中，有针对性的微生物群治疗最合适的早期目标可能是那些具有直接感染成分的疾病，如肺炎和支气管扩张症。事实上，已经发表了几项关于肠内给药益生菌的肺部效应的研究，并取得了有希望的结果[114]。在2010年对146名机械通气患者的研究中，益生菌的使用显著降低了呼吸机相关性肺炎的发展速度(40%比19%)[115]。许多研究已经检查了口服益生菌在预防上呼吸道感染方面的作用，大多数研究(17/21)都有益处[116]。以上讨论的两个小的随机对照试验显示接受益生菌治疗的患者CF恶化的频率降低[61，62]。在这些研究中，是否通过直接改变肺微生物学区或通过肠粘膜介导的全身免疫效应间接传递益处，尚不得而知。如肠内微生物移植治疗艰难梭菌的案例所示，给药途径在有针对性的微生物群干预中非常重要。吸入或直接在肺内注入益生菌或益生菌可能会对肺微生物菌群产生与肠内给药截然不同的影响。除了对肺部微生物群落的战略性操作之外，我们还可以借鉴微生物所使用的上述分子中介物的研究经验，以相互沟通，并宿主上皮细胞和炎症细胞。居民微生物可能已经产生了真正的小分子药典，可以影响局部和全身炎症、黏膜耐受性、气道反应性以及微生物的协同和拮抗作用**。

专家评论

现代独立于培养的微生物识别技术已经彻底改变了我们对居住在呼吸道的细菌群落的理解，无论是在健康状态还是在各种疾病状态下。肺微生物群的构成与临床主要结果之间的重要联系已经被观察到，进一步的研究有望阐明肺部感染和慢性肺部疾病的发病机制。这一领域将促使研究人员重新考虑长期以来关于健康和疾病呼吸道中微生物与宿主之间复杂和动态关系的观点。

五年展望

目前肺微生物学的研究还处于起步阶段，目前的研究大多局限于小样本、缺乏纵向样本和对照对象。我们预计，在未来几年，以下发展将使我们对肺微生物学及其在人类疾病中的作用的理解更加成熟：

1.样品采集、细菌生物量量化和数据分析技术的标准化。

2.不断发现新的病原体，开发确认致病性的方法，并开发准确、快速和负担得起的呼吸道感染点诊断工具。

3.对个体样本进行纵向研究，包括患病和对照，以表征肺微生物群落的稳定性和稳健性。

4.组织获取扩展到尚未被研究的呼吸道疾病。

5.非细菌性肺部微生物如病毒和真菌的研究。

6.肺微生物状态动物模型的建立及力学假说的研究。

7.微生物与寄主信号机制的探讨。

8.改进分析技术，，如功能基因组学、系统生物学和复杂系统分析。

9.微生物靶向干预的临床试验

一个勇敢的新世界：变革时代的肺微生物学

Fri, 02 Mar 2018 00:00:00 +0000

原文来自:Segal L N, Blaser M J. A Brave New World: The Lung Microbiota in an Era of Change[J]. Annals of the American Thoracic Society, 2014, 11 Suppl 1(Supplement_1):S21.

摘要

独立于培养的技术的发展改变了我们对人类细胞如何与更多的人体微生物的相互作用的理解。作为这场革命的一部分，数据正越来越多地挑战健康中的旧教条，即肺粘膜是无菌的。为了了解肺微生物组如何在人体健康中发挥作用，我们对肺微生物组研究的主要问题进行了探讨：(1)肺微生物群是无菌的吗？(2)肺内是否有独特的核心微生物群？(3)微生物种群动态如何？(4)肺免疫反应如何影响微生物组成？(5)肠道微生物群的肠道免疫反应是否影响肺部？从出生开始，我们就面临不断的微生物挑战，这些挑战塑造了我们的微生物群。在我们不断变化的环境中，肠道微生物群的扰动影响着人类的健康和疾病。由于抗生素的广泛使用，以前居住在我们体内的古老微生物正在消失，例如，胃中的幽门螺杆菌。动物模型显示，早期接触抗生素会对发育产生影响。这种改变后的微生物群对肺反应的潜在影响，对今后的研究至关重要。

随着与培养无关的技术的进步，人们对在肺中寻找微生物又产生了新的兴趣。新的观察正在挑战旧的教条，即在健康中，肺粘膜是无菌的(1，2)。随着测序技术和生物信息学分析技术的对数发展，肺微生物学的研究越来越受到人们的关注。不断变化的研究环境代表了解决人类健康中长期存在的重要问题的一个新的前沿。

肺微生物学研究中的几个关键问题

1.肺是无菌的吗？

多年来，这个问题似乎与此无关，因为没能使用培养依赖技术描述健康肺中的居住细菌。在各种因素中，肺部可培养细菌负担低，采样过程中上呼吸道微生物受到污染，以及挑剔的细菌造成了肺无菌的假设(3，4)。随着培养无关技术的使用，现在有大量的文献证明在正常人的下气道中存在细菌(5-8)。16S核糖体RNA(RRNA)基因的定量PCR结果表明，下气道的细菌负担小于上气道。然而，在健康受试者的肺中已经描述了一种多样化的微生物群。普遍发现肺内常见的是常在口腔(5，8-11)存在的分类。由于下气道的取样通常由支气管镜检查进行，因此对于这些微生物是否代表上气道微生物区系和/或微抽吸物的有争议(图1)。在随后的样品中观察到的细菌负荷的下降被认为是支持一种不可能携带的信号效应(5)。然而，在所有的研究中，这并不是一致的，这表明技术异质性很强(8)。相反，众所周知，微量吸入（菌）在健康人中是一种普遍现象，在一些呼吸系统疾病状态(12-14)中，这种现象更加严重。正常肺中细菌负荷低的观点支持了这样的观点：虽然健康的肺具有清除微生物的能力，但肺粘膜中仍存在残留的微生物。清除微生物的能力在肺部疾病中也通常受到损害(15，16)。携带和微吸入都能不同程度地促进下气道微生物群与上呼吸道类群的富集。支气管镜技术，能够更好地减少携带的贡献是必要的。此外，考虑到大多数肺样本的细菌负担较低，背景高的微生物群信号通常会干扰肺微生物群数据的解释(8)。新的基于数学建模的计算背景减法技术，如中性模型、单边异常值检验和SourceTracker，可能解释了携带，并有可能识别真正的肺分类群(7，17，18)。

解决这一问题的一个难题是确定肺微生物群的生存能力。传统上，文化技术已经被用来解决这个问题。应用16S rRNA PCR技术，目前健康肺的肺微生物学数据可能仅限于细菌DNA片段(5-9、17、19、20)。鉴于现有的数据和强大的高通量测序技术的高灵敏度，我们可能还没有准备好回答这个问题。然而，这一限制并不能使确定主要由死细菌组成的微生物群的特性的相关性失效：分类成分可能会从不活的细菌中重新获得一种由各种微生物相关分子模式(MAMPs)组成的特定的、不具有免疫调节作用的微生物群。

2.有核心微生物群吗？

肺部的生物是独一无二的吗？一个具有挑战性的观察是，下气道微生物组比另一个人的肺微生物组更类似于同一个体的上气道微生物组(17)。虽然这部分原因可以解释，如果上呼吸道迁移发生，大多数数据表明，在健康的个体(7-9，19)有很大的差异(7-9，19)。因此，确定不同个体之间的重叠程度是非常重要的。从概念上讲，寻找共同的核心符合这样的假设，即肺环境给肺部的微生物居民带来选择压力。例如，数据显示正常人肺内存在有Tropheryma whipplei(6)。重要的是，当每样本500个序列时，在上呼吸道标本中没有发现这种微生物。这一观察表明，Tropheryma whipplei通过血行扩张或微吸入到达肺。在这两种情况下，数据表明对于T.wapplei，肺是真正的合适的位置。肺的这种取向可能解释了为什么在下气道和气管内易患上气道病变的原因。有证据表明，这种微生物对下气道的定植作用在免疫功能上得到了增强，进一步表明宿主与微生物的相互作用处于动态状态。因此，我们假设微生物组分中的两个组分可能引起协同宿主反应：一个是独特的同源类群和肺环境中的一个特殊生态位，另一个是MAMPs发挥免疫调节作用的部分。肺微生物学的这两个组成部分值得进一步探讨。

3.肺微生物群的动态是什么？

随着抗生素和抗炎药的广泛应用，对肺部微生物的影响是巨大的。对肺微生物群落的干扰可以导致没有变化(抗性)、可能恢复到原来组成的改变的微生物群(复原力)、功能上可能相似的永久改变的微生物群(功能冗余)，也可能导致在组成和功能上永久改变的微生物群。这些动态变化可能与我们理解肺健康和疾病的发病机制有关。在肺中，微吸入通常是一种重复现象(12)。正如前面所讨论的，这可能解释了口腔分类群如Prevotella和Veillonella在下气道微生物群中的频繁出现。下气道这种周期性暴露于上气道的微生物是一种重要的播撒机制，可能在下气道微生物的选择中起着重要的作用。作为这种选择压力的一个例子，肺炎链球菌是上呼吸道和下呼吸道微生物的一个次要组成部分，它导致了社区获得性细菌性肺炎的一半以上。此外，下气道微生物区系的动态变化可能会引起与肺损伤的发展和/或免疫抑制状态(如囊性BroSis、支气管扩张、酗酒或HIV感染)相关的细菌趋向性的改变。几个例子的动态变化的气道微生物已被提出，以实质上影响疾病的进展。在慢性阻塞性肺疾病中，加重通常是由新菌株的获得引起的，并伴随着炎症的增加和肺功能的下降(21)。在CF中，细菌多样性的变化与疾病的进展和随后与病原体的定植有关(22)。CF气道微生物多样性随发病阶段(22，23)而明显降低。此外，在恶化事件发生前气道微生物区系的组成可能与确定参与恶化的微生物成分有关(24)。下气道微生物群多样性(Shannon多样性指数)和恶化前的假单胞菌为主的微生物群可以预测恶化期间微生物群结构的较大变化。这些数据表明，从“健康”到“不健康”的气道微生物群的动态变化会导致病原体富集和宿主伤害所必需的敏感微生物环境。研究肺部微生物群的动态变化将需要前瞻性和纵向研究。

4.肺粘膜炎症的肺微生物群提示是什么？

我们的细胞和我们居住的微生物之间的关系不是偶然的，但很可能是经过长时间的进化？(25)。肠道微生物在形成粘膜免疫系统中的作用是很清楚的(26，27)。肠道微生物区系的组成调节小肠固有层中辅助性T型17细胞与T调节细胞(Th17：Treg平衡)之间的平衡(26)。与常规定殖动物相比，无菌小鼠免疫发育不良，CD 41和CD 81 T细胞(28，29)较少。然而，肠道微生物群与肠粘膜之间的这种共生依赖于屏障机制，这种机制排除了大多数细菌，防止细菌入侵，并导致对细菌产品持续暴露的耐受性。这些重要机制的丧失可能导致细菌入侵和慢性炎症过程，例如在炎症性肠病(30)。在肺组织中，关于气道微生物组对免疫成熟的影响以及下气道出现的耐受类型，人们对此知之甚少，这可能与共生相互作用有关。来自欧洲两项大型研究的数据表明，特定的环境暴露可以保护哮喘和过敏性哮喘的发展(31，32)。利用分子技术评估与农场有关的细菌或真菌在两个队列中的暴露模式(Parsifal：预防与农业和人的生活方式有关的儿童过敏危险因素；加芙列拉：欧洲共同体查明哮喘的遗传和环境原因的多学科研究[Gabriel]高级研究)进一步将某些环境微生物定性为对哮喘的保护(33)。微生物产品的环境暴露量增加已被证明是防止过敏的保护因素(34，35)。这种微生物暴露发生在幼儿期，由分娩方式、农场居住或抗生素使用决定，所有这些都被证明是赋予保护或反过来增加日后患哮喘的风险的因素(33、36-40)。这重新引起了人们对“卫生假说”的兴趣，该假说指出，改变饮食、改善卫生条件和增加抗生素的使用，可以防止接触早期充分的免疫成熟所需的微生物。这会导致T细胞亚群失衡，例如Treg细胞紊乱，这可能会导致免疫疾病。

在无症状成人中，肺微生物组与口腔特征性组分的增加，增加了炎症细胞和呼出的一氧化氮，提示气道微生物组存在特异性的敏感性反应(8)。虽然微生物区系在刺激宿主免疫反应方面的作用似乎很明显，但目前尚不清楚观察到的关联是否是因果关系。此外，这很可能是双向关联，气道微生物区系的特征也由宿主免疫反应决定。通过观察发现，免疫不全的受试者有一个富含Tropheryma whipplei的肺微生物群，抗逆转录病毒治疗后其相对丰度也随之降低(6)。气道微生物组的其他潜在作用可能与代谢过程(如药物代谢)、控制表面活性剂的产生或气体交换有关，需要对这些领域进行更多的研究。

6.肠道微生物-粘膜相互作用与肺之间是否存在交叉对话？

肠道分析表明，肠道微生物组成与免疫系统的发育有关。此外，越来越多的证据表明，胃肠道粘膜是微生物与宿主相互作用的主要部位，在远端粘膜部位的免疫反应中起着重要作用。几个调查支持肠道微生物-粘膜相互作用与肺之间的交互的概念。在小鼠中，胃肠微生物群的破坏导致气道过敏反应异常(41，42)。在其他小鼠模型中，口服各种菌株的乳酸菌和摄入细菌产品，调节过敏性肺脏(43-45)。更重要的是，有证据表明，胃被幽门螺杆菌感染的儿童患儿童哮喘的可能性比非携带者的儿童低40~60%(46)。同样，婴儿肠道微生物多样性的减少与变应性鼻炎和外周血嗜酸性粒细胞增多有关(47)。综合起来，这些数据支持了肠道微生物影响全身免疫系统，从而影响肺粘膜的假设。另外，肠道微生物区系的变化也可能使口咽微生物区系发生变化，这可能直接影响肺微生物区系和宿主通过微吸入术产生的免疫反应。最终，肠粘膜和肺粘膜都可能是一个的系统级的器官，并共享免疫监视和宿主反应形成的生理功能，需要进一步研究，以确定与这两个粘膜位点相关的免疫学机制。

人类微生物群正在变化的证据，以及潜在的后果

古老的，垂直的

自从大约五亿年前动物在这个星球上出现以来，动物就一直有微生物在它们身上定居。这些微生物生活在它们的宿主内和宿主上的特殊的生态位中，并且在寄主生命中的相当大一部分时间内往往是持续的。重要的是，这些居住微生物中很大一部分可以被认为是宿主的正常微生物群，可以从母亲垂直传播到后代(48)。数百万多年来，这种情况一直存在，包括所有哺乳动物，如人类。

猛烈抨击

自二战以来，许多重要疾病的发病率急剧上升，包括哮喘、1型糖尿病和肥胖症(49)。由于美国(图2A)和其他发达国家的流行病不断增加，我们的研究工作集中在肥胖问题上。

出生

微生物群从母亲转移到人类婴儿的过程正面临着前所未有的限制。首先，可以公平地说，我们不知道这一问题的严重性，无论这些限制是大的还是小的，但它们是广泛的。在美国，大约有一半的孕妇在怀孕期间服用抗生素。这些会导致微生物区系在转移到后代之前的灭绝。尤其是在出生前，例如，为了防止B组链球菌感染，抗生素也可能存在于婴儿的血液和母乳中。这将对抗生素抗药性的生物创造更多的选择，并从接生的手改变婴儿的环境。此外，在美国出生的婴儿中，约有三分之一是通过剖腹产分娩的。在巴西和中国城市，碳截止率接近50%，甚至在发展中国家，如厄瓜多尔和伊朗，这一比率也超过了40%。剖腹产的一个后果是婴儿不再穿过阴道，也没有阴道微生物(50)。因此，剖腹产和阴道分娩的婴儿在出生后的各个部位–皮肤、口腔和肠道–的初始微生物区系就有不同(48)。微生物群何时以及能不能完全回到正常的发育途径还不清楚。

数据表明，通过早期暴露于致病菌(51，52)中，能够产生平衡的免疫反应，这是维持健康气道的基础。莫拉氏菌、卡他莫拉菌和嗜血杆菌在早期阶段在上气道定殖与Th2和Th17有着密切的联系，它们可能在抵抗Th1反应的同时，招募和激活嗜酸性粒细胞和中性粒细胞(52)。此外，早期呼吸道合胞病毒感染会影响调节性T细胞表型可塑性，降低T细胞的抑制能力，使宿主在以后的生命中更容易患哮喘(53)。这种呼吸道暴露于早期的病原微生物可能有助于慢性哮喘的发展和增加哮喘的风险。

早期未能建立健康的肠道微生物群也会改变免疫系统的成熟，促进成年期过敏反应的改变(54，55)。在小鼠模型中，口服万古霉素会引起更严重的过敏反应，而链霉素则不会引起过敏反应，这表明微生物成成可以在过敏敏感(56)中起作用。在一种过敏性气道疾病的小鼠模型中，无菌小鼠比传统的对照组表现出更严重的疾病，这种效应可以通过常规微生物群的再殖化来改善(57)。当饮用水中使用抗生素或抗生素-真菌组合(42，58)引起肠道微生物群紊乱时，也发现了类似的结果。早期微生物定植调节黏膜不变的自然杀伤T细胞耐受性，并能在成年后期影响黏膜部位的免疫反应(59)。调节性T细胞介导的耐受性机制可能会在肠道微生物种群，如梭菌丢失或改变(27，56)时被破坏。因此，肠道定植在生命早期对指导免疫发育和维持整个生命(60，61)的粘膜稳态起着重要的作用。

对遗传微生物的攻击并不是在出生时就结束的。幼儿经常服用抗生素。很明显，抗生素的大量滥用，特别是上呼吸道感染，包括中耳炎。在减少这一问题方面有了一些小的改进；然而，疾病控制和预防中心的数据(62)表明，儿童在每两年的生命中平均都接受了一个疗程以上的抗生素(表1)。根据美国2010的流行数据推断，当儿童达到2岁时，平均每个孩子可能正在接受近3个疗程的抗生素，10岁时接受11个疗程，20岁时接受17个疗程。这些数据与其他发达国家有限的研究相一致(63-65)。

事实上，抗生素在美国的使用显示了重要的地区差异(图2B)。2010，美国为门诊病人开了二亿五千八百万个疗程的抗生素，相当于每1000人833个疗程。在东北部和中西部，这一比率与全国平均水平相似，但西部(638/1000人)比南部(936/1000人)低约50%。由于南方人和西方人细菌传染病的发病率和严重程度可能在50%之前没有差别，抗生素使用的差异可能表明在医疗习惯和实践上的差异。有趣的是，2010年肥胖流行率和抗生素使用的地图显示出惊人的相似之处。这样的观察提出了这样一个假设，即抗生素的过量使用是导致当前肥胖流行的原因之一。

对农场的影响

这一观点的支持来源于从20世纪40年代开始的农场观察。当时，据了解，用低剂量抗生素喂养牲畜(我们简称为STAT)，可促进农场动物的生长(66，67)。有三项重要观察：

1.STAT对从鸡到牛的各种牲畜都有效，代表了脊椎动物进化的广泛范围。
2.这种作用可以用广泛的抗菌药物，不管化学结构、药物类阳离子、作用机制或目标生物。抗病毒和抗真菌药物无效。
3.开始的年龄越小，STAT的效果就越大。

这些最后的观察表明，抗生素正在影响动物的发育。因此，我们试图在小鼠模型(68)中解决这个问题。

小鼠模型

最初的工作集中在C57/BL6小鼠身上。在STAT模型中向小鼠提供多种抗生素，表明每种试验方案都改变了小鼠的脂肪发育，以及早期骨骼发育(68)。对微生物区系的研究表明，与短链脂肪酸合成有关的组成和基因丰度发生了变化，而且肝脏中有证据表明，与中间碳水化合物代谢和脂质生产和运输有关的基因的表达发生了广泛的变化。目前正在进行的工作从暴露窗口、饮食干预和抗生素干预的综合效应等方面对无污染环境进行了改进和扩展。这些研究为探索早期抗生素暴露在宿主发育中的作用提供了一个模型系统，并可能为肥胖流行的病因提供线索。

对肺的影响

抗生素的广泛应用是否对肺部微生物群的形成和动态有影响？在这一点上，很明显，我们只是不知道。抗生素可以通过其选择性作用直接影响肺部微生物群，也可以通过对肠道微生物群及其下游免疫功能的影响间接影响肺部微生物群。我们的“其他”基因组，正如人类微生物群被认为的，正面临着一个由生活方式、饮食和抗生素使用引起的重大变化的时代。利用不依赖于培养的16 SrRNA和元组学方法为我们理解肺作为一个独特的粘膜生态位暴露在复杂的微生物环境中提供了一个新的视角。我们只是在了解与胃肠道微生物群和气道有关的联系，以及人类微生物群的免疫学后果。现代微生物环境的变化和技术发展的结合，使人们能够理解人类的微生物群，这为探索在这个美好的新世界中的疾病机制提供了一个独特的机会。

肺微生物群及其对粘膜免疫表型的影响

Tue, 27 Feb 2018 00:00:00 +0000

原文来自:Wu B G, Segal L N. Lung Microbiota and Its Impact on the Mucosal Immune Phenotype.[J]. Microbiology Spectrum, 2017, 5(3).

简介

2007，美国国立卫生研究院(NIH)医学研究路线图增加了人类微生物组项目(HMP)，自那时以来，已投资二亿多美元用于人类微生物群的开发。HMP(1)研究了人体上的几个部位，包括鼻部、口腔、皮肤、胃肠道和泌尿生殖道。胃肠道仍然是迄今为止研究的最深入的器官-微生物群相互作用，其在形成宿主免疫反应中的作用在炎症反应(2-4)背景下迅速被定义。观察发现，肥胖(5-8)、冠心病(9-12)、艰难梭菌结肠炎(13、14)、2型糖尿病(15、16)和炎症性肠病(4、17、18)与特定微生物和肠道微生物群有关联。当鼻孔和口腔作为HMP的研究对象时，下气道呼吸系统不包括在感兴趣的位置。甚至在下一代测序和多路复用数据(19，20)的进展之前，口咽的微生物群落就已经被描述得很好了。微生物群进入上下呼吸道系统，在健康和疾病中，宿主和微生物之间产生了大量的联系(21-23)。在过去的几年里，我们对气道微生物群的理解发生了变化，推翻了肺是无菌场(24)这一古老的格言，变成了一个连续器官系统的新范式，它具有丰富而充满活力的粘膜表面，体现了微生物体与宿主之间的复杂相互作用，能够导致或抵抗疾病(21，24)。此外，关于呼吸微生物群如何与宿主免疫反应相互作用，人们知之甚少。虽然多个研究项目侧重于肠道微生物对胃肠道粘膜免疫反应的影响(25-27)，但很少有论文着重于下气道微生物对其所居住的呼吸粘膜的影响(23，28-30)。研究下气道微生物群的一些独特挑战包括：下呼吸道采样技术困难，健康肺中细菌负担极低，导致低信噪比，以及缺乏研究肺微生物体的动物模型(31，32)。含有高细菌生物量的器官系统中胃肠微生物组成的变化，如胃肠道，可导致广泛的观察，导致疾病状态(33)。然而，肺微生物群是一种低细菌负担器官，其微生物群的瞬时扰动对其组成的多样性和宿主对失调的炎症反应有显著的影响(23)。因此，上下呼吸道微生物群是独特的，因为它代表了一个具有显著生物量梯度的器官，从上呼吸道的一个高细菌负荷库转移到肺微生物体中的一个非常低的细菌负荷区(32，34)。我们将首先讨论上呼吸道和下呼吸道的微生物群，然后讨论微生物迁移和定植的可能机制，然后是最近发现的对微生物群的宿主免疫反应、微生物群可能影响的炎症途径，最后是针对特定疾病的可能的微生物靶标或标记物。

气道微生物群只能被理解为其各个部分的总和。在上气道，鼻腔和口腔包含一个非常独特的微生物群。在鼻腔内，微生物区系以链球菌、不动杆菌、乳球菌、葡萄球菌和棒状杆菌富集为特征。在口腔，微生物区系以富集Prevotella、链球菌、镰刀菌、Neisseria、Leptotrihia和Veillonella(35)为特征。进一步确定每个位置的质量，上气道的特点是不断暴露于空气中的微生物和微生物，作为每个人的饮食的一部分。尽管呼吸系统及其粘膜是一个连续体，但下呼吸道微生物区系有非常独特的特征，使其与上呼吸道不同。我们定义的上下气道之间的界限是由解剖结构来定义的，声带类似于一个天然的“水坝”来反对呼吸(36，37)。类似于水坝所持的水，上气道保持较高的细菌负担，而下气道微生物区系的细菌负荷则少约100至10000倍，根据16S rRNA拷贝数(32，38)。微吸入发生在正常人(39)中，其患病率在几种肺部疾病中较高，包括慢性阻塞性肺疾病(COPD)、哮喘、阻塞性睡眠呼吸暂停、囊性纤维化和非典型(如非结核分枝杆菌)和典型微生物(40-45)引起的肺部感染。

Charlson和他的同事在最初的研究中，检查了6名健康患者的支气管镜检查结果，并得出结论：下呼吸道类似上呼吸道微生物群(32)。进一步的无细胞支气管肺泡灌洗(Bal)的微生物组研究发现，口腔的细菌特征在45%的相对健康的受试者中发现，其余受试者有一个类似背景分类群(23，30)的肺微生物群。其他研究发现，口腔细菌的特征在较高的出现率，虽然这是不清楚是否与使用的样本类型(脱细胞BAL与整个BAL与气道刷)或在队列中的差异(32，46-48)。重要的是，下气道微生物区系的二分法观点(由上气道微生物富集而非)可能是下气道微生物群更可能的生理连续体的过度简化。值得注意的是，使用放射性示踪剂的较早的研究发现，类似比例的健康人微吸物(39，49)。利用独立培养技术，各种研究表明，常见于上气道的细菌也经常出现在多种疾病状态，如：哮喘(29，50-58)，囊性纤维化(59-62)，人体免疫缺陷病毒(HIV)感染(47，63，64)，晚期COPD(21，23，28，65，66)。考虑到气道粘膜的连续性，上呼吸道微生物群以其高细菌负担成为下气道微生物的主要来源，这一点不足为奇。然而，即使下气道被口腔中发现的微生物富集，上呼吸道和下呼吸道微生物群之间仍有差异(30，32)。这表明，还有其他重要因素影响下气道的动态稳态。有几个问题还没有得到回答：1)不同粘膜微生物对下气道的“异花授粉”有什么贡献；2）微生物进入下气道时受到的选择压力是什么；3)在下气道的不同室内，这种选择压力是如何变化的。

肺微生物组评价的独特挑战

肺微生物学研究尚未解决的一个特殊挑战是，在健康和早期疾病期间，微生物群信号与背景噪声的比率(图1)(31)。虽然这在晚期疾病中也很重要，但在疾病的早期阶段，在下气道样本中微生物生物量较低的情况下，信噪比是非常不利的。在功能上，肺部的细菌负担比上气道低100到10000倍(23，38)。因此，肺部系统的低细菌负担性质带来了独特的挑战：以高背景噪声信号(31)为特征的信噪比、缺乏标准的背景去除方法以及从低丰度分类群中检测信号的能力有限。这些挑战使肺部微生物群难以研究。在多项研究中，一个一致的发现是背景环境样本，如无菌盐水和支气管镜前通过支气管镜清洗(在手术之前)，含有微生物DNA，其特征是具有多样性的环境背景微生物群(30，31)。这是可以理解和可预测的，因为仪器是“干净的”，但不一定是无DNA的。此外，用于DNA分离和文库制备的试剂也可能有助于背景DNA(67)。有很大比例的健康受试者有丰富微生物DNA的下气道微生物区系，这是背景样本的特征(21，23)。因此，背景微生物群可能会使大约60%的健康受试者中的低生物量宿主微生物群发生混淆，这些微生物群将具有丰富的背景优势类群(又称肺炎菌群)(23，30)。即使在这些主题中，确定背景分类群(例如SourceTracker)对样本的贡献的生物信息方法也表明，背景样本(例如支气管镜)中近一半成分是BAL样本中没有的(30)。这一数据表明，从这些低生物量样本中仍可获得大量信息。与胃肠道的微生物群比较，这种高细菌负担和多样化的微生物群落受到多种微生物的挑战(例如食物摄入、药物治疗等)。在这种情况下，背景微生物群很少被视为重要的污染源。然而，背景微生物区系可能影响稀有或较少数量微生物的回收，或在总体污染环境中，可能在掩盖细菌组成方面起作用。由于不同的微生物或活跃的疾病过程而引起的微生物变化更有可能在胃肠道中被发现(图1A和1C)。相反，呼吸道细菌负担低，使用独立培养技术的微生物评估通常受到背景微生物群的影响。因此，当微生物干扰肺部微生物群时，由于低信号需要克服高背景噪声(图1B和1D)，它们可能不明显。该模型还表明，该信号可能是短暂的，并受动力学控制的微生物宿主在下呼吸道相互作用。当面对上气道(URT)微生物挑战时，呼吸系统的低微生物负荷可能导致微生物群的大幅度转移。微吸入术引起的微生物挑战可被看作是下气道微生物群与上呼吸道微生物的富集(也称为声门上优势类群的肺炎)(23，30)。低微生物量和信噪比是研究肺部微生物群的一个明显挑战。因此，必须将背景微生物群的研究纳入低生物量样品的微生物群研究中。

在研究下气道微生物群时，如何处理背景类群仍有疑问。测序数据的处理通常包括去除技术污染，可以作为数据上游处理的一部分进行分类群的处理。中性建模是一种可以用来识别样本类型(68)上优先富集的分类群的技术。被取样的分类群发现，偏离这一模型的是最有可能是真正的“居民”。例如，这项技术可以用来去除支气管镜中发现的分类群，以识别肺部内的微生物。SourceTracker是另一种用于估计背景微生物群(例如支气管镜)来源对生物样本(69)的微生物贡献程度的技术。虽然这些方法已被应用于肺微生物学研究中，但对于如何规范分析还缺乏共识。一个关注的问题是，在背景分类群占优势的样本中(例如，肺炎生物分类群)，去除背景分类群可能产生低读取量，并且鉴于微生物群数据的相对丰富性，将夸大未被移除的分类群的相对比例。此外，分类群清除方法有可能排除肺部和可能的污染源(如支气管镜)中存在的分类群，这可能对理解下气道微生物区系有意义。最后，细菌在疾病状态下可能具有重要的致病作用，尽管它在微生物群落中的丰度较低，去除背景分类群实际上可能改变我们对微生物在肺中的作用的理解(70)。例如，对肠毒素性大肠杆菌引起的实验性腹泻的序列分析表明，即使这种细菌丰度低，也会引起重大疾病(71）。因此，在肺中，高丰度的背景噪声是一个重大的挑战，要从低丰度的分类群中检测微生物中的信号，但可能对健康和疾病具有重要的生物学意义。

下气道微生物挑战的来源

可以预见的是，微生物来源于下呼吸道的最直接的解释是通过微吸入法从上呼吸道输送的微生物。虽然人们普遍认为口腔分泌物的吸入可能会影响肺部微生物群，但必须考虑其他可能的来源。在周围空气中的微生物群可能是下呼吸道的重要来源。人体每天能呼吸大约7000至20000升的环境空气(24，72升)，使下呼吸道暴露于空气中的微生物(空气中的微生物区系)，以及其他公认的污染物、化学物质、灰尘、过敏原和其他来自大气的微粒物质。虽然对被气溶胶化并可传播感染的病原体，如分枝杆菌(73，74)有很多的了解，但对空气中其他微生物的存在和相关性所知甚少。可能不同的空气中微生物群也可能对下气道微生物群有显著的贡献，这一课题还需要进一步的研究。

人们对复杂的空气微生物群及其对下气道微生物群的贡献有越来越多的了解。亚当斯和他的同事发现，室内环境和室外环境之间的差异是由人类相关微生物决定的(75)。在室内环境中，他们发现了棒状杆菌、链球菌、葡萄球菌、丙酸杆菌、乳球菌和肠杆菌科细菌的富集。在室外环境中，假单胞菌、Acinetobacter和Sphingomonas(75)富集。同时，Meadow和他的同事发现了一种独特的“微生物云”，它支持在封闭的空间内，周围的空气会受到其居住者的影响(76)。然而，暴露于不同空气中的微生物对肺微生物群的影响或呼出空气微生物群对空气环境微生物群的影响还没有得到研究。鼻腔微生物群与口腔微生物区系(35)不同，很可能是吸入周围空气富集的下气道的一个重要微生物库。

慢性鼻窦炎的培养独立方法已显示出流感嗜血杆菌(77，78)和其他病原体的富集，这些病原体经常与肺炎的发展有关。鼻后滴鼻与咳嗽和支气管炎症性疾病密切相关，但其对下气道微生物的影响尚未阐明。胃肠道是微生物对肺部微生物群的另一个潜在来源。胃食管反流病(GERD)在许多疾病状态中经常存在。以幽门螺杆菌为主的肠道中存在独特的微生物群，与哮喘的风险降低有关(79，80)。质子泵抑制剂的使用不仅影响胃微生物区系的组成，而且影响肺微生物群(81)的组成。此外，下消化道应被认为是潜在的肺部微生物来源。脓毒症动物模型显示，无菌动物可免受肺损伤(82)，而选择性胃肠道去污则可减少50%人(83人)多器官功能障碍综合征的发展。

然而，在下气道最常见的观察到的微生物是那些特征存在于口腔的。多元培养独立调查显示，不同受试者对口腔微生物如Prevotella、Veillonella、Rothia、 Streptococcus和Porphyromonas(23、30、65、84、85)的富集程度不同。因此，多个潜在来源可能通过不同途径的微生物攻击，如吸入、反流、血源和雾化吸入，促进下气道微生物群的形成。这些微生物挑战将成为在下气道环境中存在的独特选择压力的对象。虽然对这些选择压力在个别水平上的了解有限，但它们很可能对可能居住在较低空气通道的微生物群落的结构产生非常重大的影响。

下呼吸道微生物群独特的选择压力

几种不同的理论已经从生物学、生态学和环境研究中被用来解释肺微生物群的组成。其中最有号召力的是经改编的岛屿模式(86-88)。与岛屿相似，肺部受到来自“主陆地”微生物的迁移和它们的灭绝(86，87)之间的平衡的影响。根据这一理论，肺部可以被视为接受移民挑战的概念“岛屿”，最常见的是来自上呼吸道。因此，肺部的多样性主要是由来自微生物挑战来源的多样性和微生物生存能力的选择压力所驱动的。

近端气道，包括气管和主支气管，可被视为大面积的区域，因为它们相对于上呼吸道的位置更接近上呼吸道(32)。当汕头一个人的下呼吸道前进时，传导的气道可能代表孤立的岛屿(87，89)，有可能整合一个独特的微生物生态位。因此，多样性受到三个主要因素的影响：迁移率、淘汰率和社区成员的繁殖率(86-88，90)。健康时，这些岛屿的多样性主要取决于上呼吸道的迁移和各种清除机制，包括粘液纤毛梯、噬菌体和肺泡巨噬细胞。在健康个体中观察到的微吸入术的频繁发作很可能是微生物气道挑战的最主要来源。在发生疾病的情况下，不同的因素可能影响肺微生物群。例如，在活动性肺炎中，慢性气道定植在慢性阻塞性肺病(COPD)或囊性纤维化中，机体在下气道的繁殖率将抵消迁移和消除的机制。

此外，气道粘膜有几个独特的特点：它是一个中空的黏膜内衬管系统，在环境空气中不断地进行气体交换；它含有较高的表面活性剂(91)形式的磷脂；由于它的气体交换性质，它存在氧气和二氧化碳压力的梯度(92)。因此，微生物进入下气道时，必须克服或适应肺环境的变化。最近的研究表明，通过评估宿主内部微生物遗传变异，多个谱系可以共存，为下气道(93)提供选择性压力的证据。几个环境因素存在于下气道，使其有可能形成下气道微生物群。富含磷脂的环境不仅对维持表面张力和通气肺泡有重要作用，而且对微生物代谢(94)也有显著影响。呼吸道中存在多种抗菌肽，如表面活性蛋白A、乳铁蛋白和防御素。实验结果表明，分泌型免疫球蛋白A(SIgA)在气道微生物区系中起重要作用，其缺乏症可引起肺内微生物群炎症反应的增加，并引起气道重塑和肺气肿(95)。因此，肺粘膜的抗菌特性是微生物定植的重要障碍。为了逃避或改善宿主防御的影响，微生物已经开发和进化出了特定的机制。例如，生物膜构成自己的微生物生态位，厌氧菌可以找到最佳厌氧生态位(96)。例如，铜绿假单胞菌有利地利用生物膜来创造自己的微环境(97)。生物膜，靠好氧和厌氧菌，以及开发缺氧的微环境，可能允许微生物在厌氧条件下定植(98)。因此，虽然肺是一个高度通气的器官，但厌氧菌常在下气道微生物群中被描述，这表明生物膜可能对下气道内的有氧和厌氧菌的共存起着重要作用(96，98)。具有不同粘附性能的微生物也受到机械选择压力的不同影响，如粘液纤毛间隙(99，100)。不同的细菌表达粘附素、枕叶蛋白和鞭毛素，以克服下气道粘液纤毛的去除(101，102)。这些是细菌定植和致病的重要毒力因子，并非所有细菌都表现出这些优势。因此，在呼吸系统中发现的微生物很可能反映了一种高度专业化的菌株或物种，它们与高度免疫的粘膜(103，104)保持恒定的平衡。需要实验方法来研究这些因素如何影响选择压力，形成下气道微生物群。

肺环境生态系统也可以被认为是一系列的正向和反馈循环，抑制或允许潜在的肺细菌生长(88)。在医院环境下肺炎的一个主要危险因素是抗生素的使用(105)。有证据表明，在疾病发生前，肺部就有可能存在导致肺炎发展的病原体。在这一理论的小鼠模型中，Poroyko和他的同事对脂多糖(LPS)所致的急性肺损伤进行了研究，并研究了小鼠肺微生物组(106)的变化。这些老鼠在没有增加物种数量的情况下，明显地增加了细菌负担。此外，Proteobacteria科的丰富度也有所增加，而Firmicutes细菌的数量也有所减少。这些发现表明，对LPS的挑战可能会压倒肺内平衡的反馈机制，从而使肺内的微生物在压力和炎症期间不受抑制地增殖。营养供应也可能影响肺微生物群(107)的改变。铁的可获得性和营养免疫等问题可能会选择能够适应某些营养缺乏或丰富的微生物。此外，与病毒共感染也可能影响肺的平衡。Molyneaux和他的同事证明，当下呼吸道微生物群受到鼻病毒感染时，会发生内在的变化。在本研究中，健康受试者和有慢性阻塞性肺疾病病史的人被鼻病毒感染，并在四十二天(108年)内进行纵向追踪。通过诱导痰，作者发现鼻病毒攻击导致了Proteobacteria的增加，主要是由流感嗜血杆菌(108)的增加所驱动。这也许可以解释为什么下呼吸道肺炎发生在病毒感染后。宿主免疫系统的变化将影响下气道微生物的选择压力。这一选择的一个例子是惠普尔氏病的病因之一—Tropheryma Wapplei在治疗的肺中富集，感染HIV的患者和随后的抗逆转录病毒治疗后的T.wpplei相对丰度下降(64)。重要的是，由于在上呼吸道样本或背景对照中没有发现这种微生物，它似乎反映了宿主免疫缺陷状态有利于或促进下呼吸道的真正居民生长。最近，在晚期HIV中发现了更广泛的微生物差异，免疫重建(109)部分纠正了这种差异。Twigg和他的同事发现，在接受抗逆转录病毒疗法(ART)治疗1年后，HIV感染者的肺中发现了链球菌、Prevotella和Veillonella(63)。此外，越来越多的证据表明免疫缺陷对肺部非细菌微生物的影响，如真菌生物群落中的真菌聚集(110)。宿主呼吸系统与环境和微生物的相互作用是了解上呼吸道微生物群在健康和疾病中所起作用的一个组成部分(21、23、30)。

宿主免疫应答中的特异性缺陷对微生物群起着重要的作用。Richmond和他的同事通过研究特异性分泌型IgA(SIgA)免疫缺陷(95)的影响，探讨了黏膜免疫功能的变化。研究人员建立了缺乏聚合免疫球蛋白受体(PIgR)的小鼠模型，不能在粘膜表面产生SIgA。pIgR缺乏导致肺部微生物侵袭持续激活炎症信号(95)。缺乏pIgR的小鼠肺中的分类群增加(400对194)。野生型小鼠相比，pIgR缺陷小鼠的分类群相对丰度较高，其中包括Veillonella、Prevotella、Neiseriaceae、Bacillus、放线菌科、Tissierellaceae和Ruminococcus(95)。此外，与在常规环境中饲养的pIgR缺乏小鼠相比，无菌pIgR缺陷小鼠并没有发展出类似COPD的表型。一旦将无菌pIgR小鼠从无菌环境和微生物区系中移除后，我们测量了类似水平的气道壁重塑、肺气肿和炎症，并发现与在常规(非无细菌)条件下饲养的pIgR小鼠相同的暴露时间(95)相当。pIgR缺乏小鼠肺组织NF-κB表达上调，与野生型年龄匹配对照组(95)比较，差异有显着性(P<0.05)。这一点很重要，因为慢性阻塞性肺病的结构异常与pIgR表达降低和保护性黏膜屏障破坏有关(111，112)。

药物的使用，特别是皮质类固醇，也可能影响宿主对微生物的反应。宿主免疫反应决定宿主对微生物的易感性，从而影响病原体与共生体的区别。在免疫反应不足或改变的情况下，有规律地定植或被宿主清除的微生物可能会引起疾病。黏膜相关不变T细胞(MAIT)是人类中一种普遍而独特的T细胞群，具有检测细胞内感染细菌的能力，其中包括结核分枝杆菌(113)。MAIT细胞识别细菌核黄素合成的早期中间产物，这些中间产物能够成为这些细胞的有效抗原(113)。虽然它们能够识别出各种各样的细菌微生物，但不表达核黄素合成途径的细菌并不能刺激MAIT细胞(114)。Hinks和他的同事们证明，在11例使用糖皮质激素的患者中，外周血清和支气管活检中MAIT细胞比健康对照组少(115)。在体外研究中，接触氟替卡松或布地奈德后，非类型流感嗜血杆菌(NTHi)感染来自健康的人巨噬细胞。这些皮质类固醇的存在显著降低了MAIT细胞巨噬细胞上的一种刺激受体MR1的表达，也使MAIT细胞中NTHi诱导的IFN-γ表达减少(115)。因此，类固醇诱导的MAIT细胞抑制可能是气道疾病患者肺炎风险增加的原因(115)。

独特的肺选择压力可能对肺微生物群产生深远的影响。越来越多的证据表明，适应海岛模型可能有助于模拟微生物从微吸入术对较低气道的挑战。一旦进入较低的气道，口腔微生物很可能暴露在多种选择压力下，这些压力决定了它们在肺中的持久性或暂时性。在进化上有优势以减轻和避免宿主免疫反应的微生物更有可能在下气道微生物群中持续存在。他们克服先天和适应性免疫系统的能力可能有助于指导未来的研究，以解决微生物调控的新途径，以及可能决定这些相互作用的特定分子模式。最重要的是，宿主的反应和药物值得特别关注，因为这些机制在目前的文献中还很大程度上还没有被探讨，因为它们对肺微生物群的影响。

疾病状态下的肺微生物群

Morris和他的同事在一项关于肺微生物组的研究(85)中研究了健康受试者和健康吸烟者的微生物群。他们发现，口腔冲洗和支气管肺泡灌洗(BAL)中最常见的属是口腔中常见的微生物(Prevotella、链球菌和Veillonella)。虽然这项研究确实发现肺中的微生物比口腔中的更多，包括嗜血杆菌、肠杆菌科和疣状杆菌，但没有发现吸烟者和不吸烟者之间肺微生物区系的差异(85)。然而，尽管肺内微生物组没有发现差异，但吸烟者的口咽区与不吸烟者的口咽区却存在差异。Neisseria，卟啉单胞菌和Gemella在他们的受试者的口腔冲洗中不存在(85)。其他几项研究表明，仅吸烟就足以改变上呼吸道微生物群(20，35)，但不足以改变下气道微生物群(23，85)。

接触烟草烟雾也会大大增加你患慢性阻塞性肺疾病(COPD)的风险。与吸烟者相比，慢性阻塞性肺疾病晚期患者在肺内微生物群中有明显的改变。Erbdown和他的同事描述了终末期COPD患者(84例)肺部微生物群的这些差异。重要的是，肺的不同区域有不同的微生物群。推测肺底层结构的改变和粘液纤毛清除能力的降低导致假单胞菌和链球菌(84)的富集。其他研究也描述了COPD患者肺微生物群的差异(28，65，116)。然而，大多数COPD微生物组的研究集中在黄金期IV期COPD和从移植肺采集的样本，在这些样本中，其他混杂物，如吸入类固醇和频繁使用抗生素普遍存在，可能会使肺微生物群混淆。Hilty和他的同事还描述了哮喘和中度COPD患者(58例)肺部微生物紊乱的情况。值得注意的是，这些患者中有60%人正在进行吸入皮质类固醇治疗。

失调也可能在COPD恶化中起作用。黄和他的同事研究了一组因慢性阻塞性肺疾病加重而住院的患者(n=8)。所有的患者都是机械通气，插管，并接受抗生素(117)。研究对象的人际细菌丰富度存在差异，受试者丰富度降低的较多的是假单胞科和肠杆菌科，而丰富度增加的具有较高的相对丰度的梭菌科、藻科、杆菌科和肠球菌科(117)。在解释这些结果时，一个具有挑战性的问题可能是研究对象在研究时接受了不同长度和类型的抗生素。因此，可能与COPD加重有关的肺微生物组的变化在疾病早期可能会丢失，所见的变化可能是由于对肺微生物组(117)的抗生素效应所致。

Pragman和他的同事研究了患有相对稳定疾病的中、重度COPD患者的肺微生物群，并将其与健康人进行了比较。他们发现，虽然中、重度慢性阻塞性肺疾病组有更多的共同OTUS，但很少有OTUS(约13%)在所有三组中共享(116个)。值得注意的是，研究发现肺内有几种厌氧菌，包括Bacteroidetes细菌、镰刀菌和梭菌属，观察到厌氧细菌是在有氧环境中发现的，但尚不清楚这些厌氧菌是否具有代谢活性(116)。在这项研究的亚分析中，作者发现最具判断力的因素是吸入类固醇的使用。强调药物对微生物组的影响，最近的一项研究表明，在早期肺气肿患者中，使用阿奇霉素会影响下气道微生物群的多样性，并增加可能具有抗炎作用的应激相关微生物代谢物(118)。该数据进一步支持下气道微生物组在下气道黏膜免疫表型中的作用，并说明药物的选择性压力。

利用移植肺的核心活检，Sze和他的同事也发现了晚期COPD患者的差异，相对高丰度的Firmicutes，包括乳酸菌和变形杆菌(65)。然而，在一项后续研究中，同一研究人员发现，当他们将COPD患者的肺标本与移植供者的肺标本进行比较时，Proteobacteria门的相对扩张和Firmicutes的减少(28)，说明很难定义一致的“核心”COPD微生物群。最近一项研究的一个重要发现是，有几个类群与宿主的免疫反应呈正相关和负相关，包括中性粒细胞浸润、嗜酸性粒细胞浸润和B细胞浸润(28)。

尽管有研究在黄金期IV COPD检查肺微生物组，早期COPD，中度COPD，和积极吸烟者仍然很难研究，并在肺微生物组的研究中表现出知识的缺乏。由于几个具有挑战性的问题，应注意这些人群，包括：需要研究疾病过程中的早期事件，控制和限制吸入糖皮质激素等可能的混杂因素，以及关注肺部微生物群的纵向变化。

在哮喘中，有证据显示有Proteobacteria富集，包括嗜血杆菌属(29，119)。重要的是，不同的免疫表型与下气道微生物群的变化有关。与无哮喘患者相比，哮喘患者的呼吸道细菌负担更高(119)。在幼年暴露于不同的过敏原和微生物(来自动物或环境)证明对哮喘的发展有保护作用，从而支持“卫生假说”(120，121)。相反，肺微生物群中的几个分类群，包括肺炎链球菌和流感嗜血杆菌，一旦在新生儿宿主中定植，就会增加哮喘的易感性(122)。黄和他的同事研究了患有肺部微生物紊乱的哮喘患者。他们发现气道的多样性与支气管高反应性增强密切相关(119)。此外，他们还发现，与支气管高反应性密切相关的分类群主要属于变形菌门。克拉霉素治疗结果显示，克拉霉素治疗后支气管反应性改善者的Shannon多样性指数(α多样性)(119)有所提高。

在严重哮喘患者中，黄和他的同事也试图对哮喘不同表型的患者的相关微生物群进行研究。他们发现，拟杆和厚壁门(包括Prevotellaceae、支原体科、Lachnospiraceae和Spirochaetaceae)的富集与肥胖的哮喘患者有关。他们还确定了与哮喘症状恶化有关的某些分类群，如Proteobacteria（Pasteurellaceae, Enterobacteriaceae, Neisseriaceae, Burkholderiaceae, and Pseudomonadaceae)(123）。研究人员证明，不同的哮喘表型可能隐藏着不同的微生物，支持肺微生物学体在宿主免疫表型上的一个重要方面(29)。在囊性纤维化中，气道清除紊乱是由于氯化钠通道功能障碍，导致分泌物增厚，并导致微生物气道定植和感染。根据培养的数据，在囊性纤维化患者的气道中发现了临床上有意义的细菌，包括铜绿假单胞菌(124)、头孢菌素复合物(124)、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(125)和鸟分枝杆菌复合物(126)。早期囊性纤维化的微生物群研究发现，囊性纤维化的核心微生物群可能由7个属的15个分类群组成，其中包括Catonella、Neisseria、Porphyromonas、Prevotella、Pseudomonas、Streptococcus和Veillonella(127)。囊性纤维化患者的肺可能存在高度的空间异质性(128)。在一项由Coburn和同事进行的269名囊性纤维化患者的研究中，研究人员研究了广泛的年龄和疾病阶段(128，129)。这项研究再次确认某些物种属于可能的核心微生物群，包括链球菌、Prevotella、Rothia、Veillonella和放线菌(129)。较典型的囊性纤维化相关微生物(如假单胞菌、伯克霍尔德菌、葡萄球菌和嗜铬杆菌)不太普遍，但当痰标本中出现时，往往占样本内相对丰度的主导地位(129)。

此外，Coburn和他的同事发现，10岁以下患者的群落多样性和肺功能最高，25岁时达到一个平台，随后几年社区多样性下降与肺功能恶化有关(129)。曾经被认为是口腔污染物的细菌可能是肺生态学(90，130)中重要的口腔微生物，也可能是囊性纤维化(131)宿主炎症反应的潜在来源。

肺肠轴及其在疾病中的作用

肠道是人体内微生物群的主要聚集地。有证据表明，胃肠道对宿主的免疫启动起着重要作用。这种免疫功能不仅限于肠粘膜或全身循环，而且有越来越多的证据表明，通过肠与肺之间的免疫关系相通。因此，胃肠道不仅可以与下呼吸道直接相互作用(例如吸入)，而且还可以作为免疫调节器官，与先天和适应性免疫系统(树突状细胞和巨噬细胞)有关的其他器官相互作用，并在疾病到呼吸道时可能具有炎性细胞因子和趋化因子(60、132、133)。

对哮喘的微生物群研究也发现了可能的肺和肠道相互作用。幼年接触牲畜或犬类的风险显著降低(134，135)。直到最近，保护这些人免受哮喘发展的机制仍未确定。藤村和他的同事们用从狗家收集的灰尘进行了实验来探索这种联系(25)。暴露在狗居住的房子灰尘中的老鼠对过敏原有保护作用。特别是，接受狗家尘的小鼠胃肠道中的johnsonii乳杆菌相对丰度增加(25)。口服补充这一单一种类的乳酸菌可降低支气管对过敏原和呼吸道合胞病毒的反应。此外，作者声称，虽然他们能够在盲肠标本中检测到约翰逊氏菌，但在肺标本中却没有检测到任何一种，证明胃肠道微生物群对局部和全身炎症反应有影响(25)。

囊性纤维化小鼠模型显示，由于抗生素治疗后肠道微生物群的改变肺微生物学体有明显的调节作用(136，137)。Bazett和他的同事们发现，链霉素在小鼠囊性纤维化模型中，这种抗生素不是从肠道系统吸收的，与野生型小鼠时相比，用链霉素(136)治疗的肺IL-17和γδT细胞减少有关。因此，肠道微生物群在囊性纤维化(138，139)中也起着重要的免疫调节作用。

肠道微生物群的变化也与人类异基因造血细胞移植的肺部并发症有关(140)。革马蛋白杆菌(Gammaprotein)–以肺炎克雷伯菌和氧化克雷伯菌为成员的粪便微生物群占主导地位，与肺部并发症有关，死亡率增加了一倍(140)，表明肠道有助于移植早期肠道细菌的移位，或可导致由微生物引起的局部或全身炎症途径造成的间接肺损伤。肠道微生物群也可以减轻和保护脓毒症(141-143)。用抗生素根除胃肠道微生物群与感染肺炎链球菌的小鼠体内存活率显著降低有关，肺炎链球菌感染后肺泡巨噬细胞的细胞因子(如IL-1β、IL-6和CXCL 1)表达上调，IL-10和TNF-α表达下调(144)。

肺-肠相互作用的程度仍需进一步澄清。这两个器官之间有着清晰的联系，两个器官都代表着很大面积的粘膜表面，它们可能有相似的免疫途径。因此，肠与肺的相互作用暴露出缺点，当描述肺部或肠道微生物组的免疫效应时。新的证据表明，肠-肺轴代表了这两个器官之间的交流和信息共享领域。未来的研究方向是定义和完善这些相互作用，并利用它们使宿主受益。

微生物对下气道环境炎症通路激活的影响

宿主呼吸系统与环境和微生物群的相互作用是理解上下呼吸道微生物群在健康和疾病中的作用的一个组成部分(21、23、30)。尽管目前肺微生物组文献中的例子很少，但有几份手稿已经证明了肠道微生物组在粘膜免疫系统中Th17反应的成熟中的作用(2，145-147)。在胃肠道文献中，有证据表明胃肠道微生物在健康和疾病中起着重要的免疫调节作用(2，146，147)。特别是，Th17反应在粘膜表面引起人们的兴趣，Ivanov和他的同事们证明，分段丝状杆菌(SFB)似乎在胃肠道Th17细胞的分化中起着一定的作用(2，147)。此外，Suzuki和他的同事证明，在IgA缺乏的小鼠模型中，异常和不受控制的免疫反应与SFB在这些小鼠体内的增殖有关(148)。总之，肠道微生物群在免疫反应的成熟中起着必要的作用。然而，肺微粒体也可能在粘膜免疫反应中发挥重要作用。

在肺粘膜中，健康患者微生物学组的变化与亚临床炎症有关(23)。在肺微生物群的二分法分组中，可识别出两种不同的肺微生物(肺型)：一种是以声门上优势类群富集为特征(肺门-图2)；另一种是以背景优势菌群富集为特征的肺炎型(肺炎菌群-图2)(23)。与上呼吸道的相似性程度也可以用来表征肺微生物群，在BAL中，以声门上占优势的类群(肺门为主分类群)富集BAL样本时，出现了较低的UniFrac距离(基于相对丰度和系统发育树的不同)，但这些分类群的代谢活性目前尚不清楚(93，149)。此外，这两种肺炎类型的队列组织(图2)得到了噬菌体数据的支持(30)。噬菌体数据的恢复表明，不同的噬菌体被选择到不同的类群中，说明肺的生态梯度可能影响病毒和微生物群。来自该群体的噬菌体数据也支持一个积极复制的噬菌体群体的存在，因此，为了有一个活跃的噬菌体群体，意味着也有一个活跃的微生物群落(30)。重要的是，富含口腔分类群的下气道微生物群与独特的基因组潜力有关，并与多种微生物来源的代谢物有关。这提供了在较低气道中微生物代谢活跃的证据。宿主不仅是下呼吸道微生物群相互作用的旁观者，而且还可以受到细菌代谢的副产品的影响或受益。最近的一项研究表明，阿奇霉素在早期肺气肿中的应用促进了细菌产生抗炎代谢物(118)，提示大环内酯类药物的一些抗炎作用可能是由其对下气道微生物代谢的影响所介导的。

此外，肺微生物群的差异与一种独特的免疫表型有关，表明肺微生物群不是旁观者的共生体，而是与宿主免疫系统相互作用。具体来说，声门上占优势的类群(肺炎)的富集与Th17的炎症表型有关(图2)。下气道微生物群最有可能是肺通气功能异常的积极参与者，与URT相似的标本也与Th17-趋化因子：IL-1α、IL-1β、Fractalkine和IL-7(30)有关。此外，对气道刷的转录组分析表明，对Th17分化重要的因素，如STAT 3和TSLP，与肺通气性小孢子虫有关。鉴于健康志愿者和那些接触香烟烟雾的人都发现了这些微生物群信号，这表明下气道的富集不受疾病影响(图2)。

其他研究也发现了与严重哮喘患者Th17表型相关的微生物特征(29)。这种表型发生的机制在肺中尚不清楚。黄和他的同事对严重哮喘患者的研究发现，Proteobacteria与Th-17相关基因的表达相关，包括Pasteurellaceae、肠杆菌科和Bacillaceae。虽然FKBP 5基因与哮喘中类固醇反应性相关，与Th17炎症相关，但与Proteobacteria特定科没有明显重叠，表明尽管有一个共同的门，但不同的微生物对下气道有不同的影响(29)。因此，独特的气道微生物群可能促进Th17相关炎症，但可能与FKBP 5相关的类固醇诱导效应无关(29)。与Th17炎症相关的微生物的鉴定可能是另一种独立于Th2和嗜酸性反应的炎症途径。Th17炎症表型可能是某些哮喘患者的重要免疫调节靶点，尤其是具有中性粒细胞表型的哮喘患者(29)。然而，Th2表型与微生物群数据(29)没有显著的相关性。

此外，Yadava和他的同事在实验小鼠模型的研究中发现，由于γδ+T细胞表型(150)的增加，暴露于LPS和弹性蛋白酶的肺微生物学体中，IL-17A的表达增加。这种小鼠的炎症表型与气道异常和肺气肿相似，类似于人类COPD。LPS和弹性蛋白酶对小鼠的BALα多样性降低，假单胞菌、乳酸菌和金杆菌(150)相对丰度增加。研究人员发现，微生物群通过使用微生物群耗竭的小鼠，促进γδ+T细胞产生IL-17A。重要的是，研究人员通过从LPS和弹性蛋白酶处理的小鼠身上转移丰富的微生物，同时与LPS和弹性蛋白酶共同挑战抗生素处理的小鼠(150)，重新表达了上调的IL-17A免疫表型。本实验证明肺微生物群在免疫表型上具有一定的功能作用，但该作用的个别成分仍需明确阐明。在本研究中，LPS和弹性蛋白酶的使用引起了类似于Poroyko及其同事的研究的问题，即诱导Th17表型所需的是活的复杂微生物群落还是病原体相关的分子模式(PAMPS)。此外，LPS可能会有不同的影响，取决于来源的生物体，通常是大肠杆菌，因此可能不是从常见的微生物在较低的气道(106，150)。鉴于下气道微生物群的复杂性，其他微生物产物也可能对下气道(106，150)的宿主免疫表型发挥重要作用。

Th17表型的存在和IL-17的上调对下气道的微生物群落有重要意义。下呼吸道微生物群不是无反应的乘客，而是刺激和减弱先天和适应性免疫反应的发展。在此，由类似上呼吸道微生物群的微生物群所定义的失调与亚临床的促炎表型(30)有关。复杂的代谢相互作用与这种微生物区系失衡有关。此外，也有证据表明，由一个独特的肺微生物群触发的反调节机制的激活。肺泡巨噬细胞收集自具有下气道微生物组特征的细菌，与TLR 4反应减弱有关，TNF-α、MDC、IL-6和GM-CSF在LPS刺激下产生减少(30)。这种减弱的天然免疫反应在这个独特的肺微微生物群因此可能是一个重要的抗调节机制，在肺泡巨噬细胞在肺粘膜需要减轻炎症免疫反应(3，30，145，147)。这与其他器官系统中发现的多种其他反调节机制相一致，包括胃肠道(3，145-147)。

Th17炎症通路和IL-17上调并不是唯一可能被上调的宿主肺功能失调的途径。Richmond和他的同事们的研究也证实了pIgR缺陷小鼠粘膜免疫功能的丧失导致微生物侵入上皮细胞(95)。相比之下，野生型小鼠和pIgR缺乏型小鼠气道腔内细菌的百分比并没有差异，这表明这种影响仅仅是由于微生物的入侵所致。pIgR缺乏症小鼠在BAL液(95)中也显示NF-κB通路与NF-κB依赖性的趋化因子(KC)有关。综合起来，这个小鼠的黏膜免疫缺陷模型是另一个途径的例子，它是由下气道内固有的微生物相互作用激活的，是一个研究的目标。

代谢产物和细菌代谢产物也将对肺微生物组具有免疫调节作用。慢性炎症是囊性纤维化对肺系统的影响的典型代表。炎症的机制主要是由典型的囊性纤维化微生物定植而来，但也有来自兼性厌氧菌的厌氧代谢，这些厌氧菌在微生物组分中所占的比例较小(90)。具有兼性厌氧代谢能力的微生物常在口腔中发现，并已在囊性纤维化患者的下气道中被发现。短链脂肪酸(SCFAs)是厌氧代谢的副产品，已被证明能改变和影响囊性纤维化(131)中的炎症。

肺粘膜表面是与外部世界的重要界面，它在清除微生物并对微生物作出反应的先天和适应性免疫反应中发挥作用，提供肺泡巨噬细胞(肺泡巨噬细胞)，这些巨噬细胞维持着从被调理的微生物中呈递抗原的重要作用，并具有调节信号细胞因子和趋化因子的能力(151)。上述数据表明，有多种证据支持下气道微生物体在维持下气道粘膜免疫张力方面的重要作用。这种反应可能是激发免疫系统所需的“健康”免疫音调的一部分，也可能在多种气道炎症性疾病的炎症过程中发挥重要作用。

微生物群的研究已经发现了一个复杂多样的微生物群落，居住在我们的体内。利用多组学，我们可以评估微生物和宿主之间的动态平衡。这种复杂的微生物群落与宿主免疫系统相互作用的新观点迫使我们重新考虑科赫关于疾病的经典假设。最大的挑战是如何认识到复杂的微生物群落可能在影响其微环境，包括宿主免疫反应(152)方面具有相互作用和积极作用。引起疾病的微生物群落的影响对科赫的假设提出了挑战，因为它们通常被用来理解单一微生物是如何导致疾病的。这些假设被用来将微生物归类为病原体(153)。在微生物群落与宿主相互作用并影响其环境的情况下，微生物及其群落的“致病”作用可能需要重新定义(154，155)。因此，可以从微生物与宿主的相互作用、受微生物自身毒力因子、相关微生物群和宿主免疫反应影响的界面来看待致病性。

目前，我们对许多肺部疾病的认识受到关联研究的限制，人类和小鼠模型中的功能研究尚未完成。这些不同的相互作用和机制可以通过对代谢组学、代谢组学、代谢组学、元蛋白质组学、病毒学和其他“组学”研究(22、23、30、155)进一步阐明。使用这些方法对于了解微生物群落如何影响健康和疾病以及把群落作为一个整体来看，对科赫假设的经典方法提出挑战将是非常重要的(155)。

结论

呼吸粘膜代表着人类宿主和环境之间的广泛和包罗万象的边界。胃肠道与呼吸道的差异，如微生物浓度、器官长度、取样方便性、生理参数的差异等，都是肺微生物研究中具有挑战性的细微差别。注意力已从了解呼吸道微生物群的生态组成转移到若干关键问题，包括：特定微生物群落的定植和持续存在、在特定群落存在时被上调和下调的炎症途径以及这些炎症途径的功能和机制原因(23、30)。

肺部通过不同的机制，如空气消化、反流和夜间微量吸入，可以看到多种微生物的挑战(38)。这些重复的微生物挑战可能在宿主免疫应答(23，30，156)中发挥重要作用。对宿主免疫状态的影响可能代表有益的免疫启动，或有助于疾病发展的致病免疫过程。

下呼吸道肺微生物群的未来发展方向将需要重点研究微生物群落功能，了解微生物与微生物之间的相互作用，建立揭示因果关系的实验模型。最终，我们的目标是寻找潜在的微生物靶点，以便更精确地操纵下气道微生物群，如精细使用抗生素、噬菌体疗法或针对特定微生物代谢途径的分子，以改变肺部疾病的自然过程。

肺微生物学--健康与疾病呼吸细菌学的新原则

Tue, 27 Feb 2018 00:00:00 +0000

原文来自：Dickson RP, Huffnagle GB (2015) The Lung Microbiome: New Principles for Respiratory Bacteriology in Health and Disease. PLoS Pathog 11 (7): e1004923. doi:10.1371/journal.ppat.1004923

简介

呼吸微生物学的原理正在被重新评估和改写，从肺无菌神话的被揭穿开始。呼吸道生态系统的“地形”在解剖学和生理学上与其他粘膜部位不同，当宿主和微生物群之间的动态动态平衡被破坏时，疾病的“地形”会发生剧烈的变化。研究人员才刚刚开始了解病毒、噬菌体和真菌对肺微生物群的贡献，因此，我们的讨论仅限于肺部的细菌微生物群。

肺不是无菌的

关于肺部无菌的概念仍然经常在教科书中提到，几乎总是没有被引用。如果这一说法属实，那将是非同寻常的。细菌是非常多样化和适应性强的；因此，地球上几乎没有一个极端的环境生态位(在氧气、pH、疏水性、温度、盐度、捕食者、营养缺乏等方面)，以至于找不到细菌群落[1]。如果这个星球上罕见的无细菌环境之一是口腔下方几英寸处发现的温暖潮湿的粘膜，这将是非常值得注意的，在这个环境中，充满细菌的空气、微气溶胶和液体源源不断地流动。许多研究，可追溯到近一个世纪前，已经证明微吸入（细菌）在健康、无症状的受试者中很常见[2-5]，而对吸入空气中细菌含量的了解与细菌理论本身一样古老[6]。自健康肺微生物群的第一次独立培养报告[7]以来，30多项利用分子技术进行细菌鉴定的研究已经发现了下气道细菌的证据。没有现代研究发现他们缺席的证据。

粘膜生物学：肺不是肠道

虽然肠道和肺都是粘膜内衬的腔内器官，具有共同的胚胎学起源，但它们的大体和微观解剖特征是非常不同的，它们的微生物动态组成和种群有着明显的差异。在没有呕吐或食道反流的情况下，消化道微生物的迁移是单向的(从口到肛门)，并被广泛变化的物理和化学屏障所打断。为了使一种口服微生物进入盲肠，它必须忍受胃的酸性pH(~2.0)和十二指肠的碱性pH(~8.0)，并与人口稠密的居民微生物群争夺资源。相反，空气、粘液和细菌在肺中的运动是双向的，在喉和最远端的肺泡之间没有物理屏障。因此，肺部的微生物群比下消化道的微生物群更动态、更短暂。胃肠道在整个9米长的过程中温度一致(37°C)，而呼吸道粘膜(短半米长)是从吸入点的环境温度到肺泡核心体温的梯度[8]。与肠道不同的是，肺环境富含氧气。虽然气管和支气管和肠道一样，内衬着分泌粘液的糖基化蛋白，但肺的大部分表面积都内衬着富含脂质的表面活性剂，对某些细菌物种具有抑菌作用[9]。气道内细菌密度很小，与十二指肠相当[7]，比大肠小几个数量级，因此细菌间代谢相互作用明显不同。最后，肠道和肺部在宿主-细菌相互作用的特征上存在差异。肠道内IgA水平要高得多，而肺中细菌与宿主白细胞(肺泡巨噬细胞)之间的腔外相互作用要多得多。这些明显不同的环境条件共同导致相应的不同微生物群落。

肺微生物群由三个生态因子决定

肺微生物群的组成由三个因素的平衡决定(图1)[10]：(1)微生物进入气道，(2)从气道清除微生物，(3)由区域生长条件决定的群落成员的相对繁殖率。微生物群的任何变化–个体内部或疾病状态–都必须由这些因素引起的扰动所致。微生物迁入的来源包括吸入空气(在到达细菌密集的上气道之前就含有104-106细菌/mm3)，亚临床微量吸入上呼吸道内容物[2-5]，以及直接沿气道粘膜扩散。微生物的清除是由粘液纤毛清除、咳嗽(甚至在健康受试者中经常发生)和宿主免疫防御(包括先天和适应性)驱动的。决定肺部局部生长条件的环境条件包括所有环境生态位共同的环境条件(如营养供应、温度、pH、氧分压)以及宿主炎症细胞的丰度和激活状态。在健康时，这些条件通常不利于细菌生长，导致细菌繁殖相对较少；因此，健康中肺微生物群的主要决定因素是迁入和消除的平衡[13-15]。然而，在疾病期间，肺部的局部生长条件发生了巨大的变化，为细菌的选择性繁殖创造了有利的条件。在晚期肺部疾病中，细菌定植的长期现象反映了物种的丰富增长，这些物种很好地适应了受伤呼吸道的特定环境条件。肺环境对这些社区成员的选择性生殖优势已经压倒了移民和消除对呼吸生态系统的动态影响。

口腔微生物是健康期间肺部细菌菌群的主要来源

咽部分泌物亚临床微吸入在健康人群中的普遍存在是一项长期建立和验证的观察[2-5]。此后，许多独立于培养的研究证实，肺的微生物群与口咽的微生物群相比，更接近于与之竞争的源群落：吸入空气、鼻咽或通过血源扩散的下消化道[15-18]。一项直接的个人研究和一种基于群体的大型模型都表明，鼻腔微生物群对健康的肺部微生物群贡献很小[15，16]；鼻子的微生物群比肺的更接近皮肤。重要的是，即使通过鼻进支气管镜取样（表明上呼吸道污染对经支气管镜获取的标本的影响最小），肺部和口腔微生物之间的这种相似性也是明显的[10，19]。口咽每天产生两升唾液，比健康的鼻粘膜分泌的分泌物要大得多。肺和鼻微生物群落有可能(但没有被证明)在鼻漏增加的时候聚集在一起(例如急性病毒感染或变应性鼻炎，两者都可能引起与鼻腔微生物有关的肺部疾病的恶化，如金黄色葡萄球菌和卡他莫拉菌)。

疾病期间肺微生物群的变化

肺部微生物群的生态决定因素–迁移、消灭和区域生长条件–在急慢性肺病期间都发生了巨大变化[10]。因此，肺部微生物组的群落成员在疾病状态下会发生改变。在数十项研究中，比较了患病肺的微生物群和健康受试者的微生物学，几乎所有的研究都发现了社区组成上的显著差异[20]。许多人描述了慢性气道中群落丰富度(物种的数量)的增加，通常是随着群落组成从控制健康肺微生物群的Bacteroidetes菌门转向含有许多常见的肺相关革兰氏阴性杆菌的门-Proteobacteria菌门。肺微生物区系的基线差异与慢性肺疾病的重要临床特征有关：支气管扩张症的继发恶化频率[21]，特发性肺纤维化的死亡率[22]，哮喘对皮质类固醇和抗生素的反应性[23，24]。该领域活跃的研究课题包括：(1)肺微生物学组是否参与疾病的发病，还是仅仅是损伤和炎症的标志；（2）肺微粒体是否能被治疗性地操纵以改变恶化频率或疾病进展；(3)肺生态系统的多样性和动态平衡是如何崩溃的，并由肺炎中单一的优势病原体主导[14，25]。

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细菌微生物组在肺病中的作用

摘要

简介

I.肺微生物群分析方法

II. 健康肺的微生物群

III. 疾病肺的微生物群

IV.呼吸系统疾病的一般主题

V. 肺外微生物群研究的经验教训、意义和假设

专家评论

五年展望

1.样品采集、细菌生物量量化和数据分析技术的标准化。

2.不断发现新的病原体，开发确认致病性的方法，并开发准确、快速和负担得起的呼吸道感染点诊断工具。

3.对个体样本进行纵向研究，包括患病和对照，以表征肺微生物群落的稳定性和稳健性。

4.组织获取扩展到尚未被研究的呼吸道疾病。

5.非细菌性肺部微生物如病毒和真菌的研究。

6.肺微生物状态动物模型的建立及力学假说的研究。

7.微生物与寄主信号机制的探讨。

8.改进分析技术，，如功能基因组学、系统生物学和复杂系统分析。

9.微生物靶向干预的临床试验

一个勇敢的新世界：变革时代的肺微生物学

摘要

肺微生物学研究中的几个关键问题

1.肺是无菌的吗？

2.有核心微生物群吗？

3.肺微生物群的动态是什么？

4.肺粘膜炎症的肺微生物群提示是什么 ？

6.肠道微生物-粘膜相互作用与肺之间是否存在交叉对话？

人类微生物群正在变化的证据，以及潜在的后果

古老的，垂直的

猛烈抨击

出生

对农场的影响

小鼠模型

对肺的影响

肺微生物群及其对粘膜免疫表型的影响

简介

肺微生物组评价的独特挑战

下气道微生物挑战的来源

下呼吸道微生物群独特的选择压力

疾病状态下的肺微生物群

肺肠轴及其在疾病中的作用

微生物对下气道环境炎症通路激活的影响

结论

肺微生物学--健康与疾病呼吸细菌学的新原则

简介

肺不是无菌的

粘膜生物学：肺不是肠道

肺微生物群由三个生态因子决定

口腔微生物是健康期间肺部细菌菌群的主要来源

疾病期间肺微生物群的变化

4.肺粘膜炎症的肺微生物群提示是什么？