摘要
- 基本原理: Hilty和同事根据表面刷刷和支气管肺泡灌洗液，研究发现了哮喘和慢性阻塞性肺疾病( COPD )患者肺中的微生物群，这些微生物群现已被其他人证实。
- 目的:将这些发现推广到人肺组织标本。
- 方法:从非吸烟者( n48 )；无COPD的吸烟者( n48 )；极重度COPD患者( COPD全球倡议[GOLD] 4 ( n48 )；囊性纤维化( CF ) ( n48 )肺组织中提取DNA。后者作为阳性对照，无菌水作为阴性对照。所有细菌群落分析均基于聚合酶链反应扩增16S rRNA基因片段。通过定量聚合酶链反应测定细菌总数，通过末端限制性片段长度多态性分析和焦磷酸测序评价细菌群落组成。
- 测量和主要结果:肺组织内细菌总数较小(每1000人细胞20 - 1 252个细菌细胞)，但与阴性对照组相比，所有四个样品组的细菌总数都较大( P，0.001 )。末端限制性片段长度多态性分析和测序区分了三种不同的细菌群落组成:一种是不吸烟组和吸烟组共有的，另一种是[GOLD] 4组，第三种是CF阳性对照组。焦标签测序鉴定出超过1400个独特的细菌序列，并且显示在金4患者中，与所有其他组相比，由于乳杆菌属的增加( P，0.0007 )，厚壁菌门增加( P，0.003 )。
- 结论：在非常严重的COPD患者中，人肺组织内有可检测的细菌群落。
慢性阻塞性肺疾病( COPD )是一个严重的公共卫生问题，预计到2020年将成为全球第四大死亡原因( 1 )。虽然持续吸入有毒颗粒和气体是主要的危险因素，吸烟是这类危险的最佳例子，但实际上只有一小部分吸烟者( z15 % )患上COPD ( 2 - 4 )。尽管吸烟者的免疫系统功能失调，增加了发生微生物感染的风险，这种风险在戒烟时可以得到缓解( 5 )，但COPD的发展和疾病严重程度的增加逐渐加重了炎症细胞的负担( 6 )。最近的证据表明，较小细支气管的变窄和破坏是直径小于2mm的小传导气道( 7 )中流动阻力增加的原因。此外，这个过程开始于肺泡表面的肺气肿破坏开始之前，肺泡表面的肺气肿破坏减小了可用于将空气排出肺( 7 )的弹性反冲力。对这些病变组织学的定量研究表明，它们与浸润CD41 T细胞和B细胞的积累有关，这些细胞在严重( COPD全球倡议[金)和非常严重(金4 )的COPD ( 6 )中形成三级淋巴器官的数量增加。这些结果支持这样的假设，即先天性和适应性免疫应答对COPD周围肺病变的病理起作用，但驱动这种应答的抗原仍有待确定( 8 - 13 )。一些人认为自身抗原驱动COPD ( 14 )的发病机制，而另一些人则认为新菌株的出现( 9 - 11，15 - 18 )引发感染、炎症和功能失调修复的循环，从而驱动COPD ( 10，15 )的进展。随着COPD进展而发生的恶化的频率和严重程度的增加可能是这种感染和炎症恶性循环的表现( 19 )。最近Hilty和同事( 20 )支气管刷样本的报告表明，正常吸烟者的肺中存在微生物群，并且COPD中的这种微生物群变化刺激了基于支气管刷、支气管- veolar灌洗( BAL )样本、气管内抽吸物或肺组织( 21，22 )的肺微生物群的进一步研究。本研究使用肺组织样本，并通过对非常严重的COPD (金4 )、不吸烟和控烟子项目以及囊性纤维化( CF )患者的肺组织中的细菌菌群进行深入分析来扩展这些先前的发现。我们通过定量聚合酶链反应( QPCR )、末端限制性片段长度多态性( TRFLP )分析和焦标签测序等方法扩增和分析16S rRNA基因来表征这些样品中的细菌群落。这些研究的一些结果以前以摘要的形式报告过( 23 )。
1、方法
1.1 研究对象
非吸烟者( n48 )和吸烟者( n48 )的肺是通过肺癌外科切除获得的，或者是从移植供体获得的，当没有合适的受体时，这些供体的肺被释放用于研究。从接受肺移植治疗的患者中获得非常严重的COPD (金4 ) ( n48 )或CF ( n48 )肺。非吸烟者和吸烟者的年龄和性别与金4受试者相匹配。所有病人及捐出肺作移植用途的病人的近亲均同意接受移植。这项研究得到了有关机构的适当委员会的批准。
1.2 肺组织DNA提取方法的研究
在肺门水平从右肺或左肺的横向切片收集组织样本。初步实验显示细菌总数的变异依赖于肺的高度，其中肺门水平显示最高的总细菌(数据未显示)。DNA提取的过程在联机补编中描述。来自CF ( n48 )受试者的肺样品作为阳性对照样品，因为已经确定它们的肺含有细菌( 24 )，无菌水作为阴性对照。
1.3 定量PCR分析
QPCR使用引物和在线补充物中描述的循环条件( 20，27，28 )扩增跨越16S rRNA基因( 25，26 )的高变区V2的293 - BP靶片段。在对阴性对照样品中的细菌数量进行校正因子之后，将细菌数量标准化为单拷贝基因Rpp40 ( 29 )。详情见在线补编。
1.4 TRFLP
TRFLP使用限制性内切酶HHaI ( 30 )消化FAM标记的881 - BP PCR产物，该产物跨越高变区V1 - V3 (见在线补编) ( 25 )。
1.5 焦标记测序
焦磷酸测序的嵌套PCR使用第一轮引物和881 - BP TRFLP靶和第二轮引物的循环条件来扩增跨越V1 - V3高变区的550 - BP序列(见在线补充)。所有CF样品也通过使用第二轮引物的无竞争PCR进行分析，以比较两种方法。PCR产物使用GS - FLX 454平台(加拿大蒙特利尔麦吉尔大学魁北克基因组创新中心)进行测序。
1.6数据分析
用Kruskal - Wallis非参数检验对焦磷酸测序数据进行QPCR和phyla分析，并用Bonferroni校正进行多重比较。通过PC - order ( MJM软件设计，Gleneden Beach，OR )加上非测量多维标度( 31 )和测量T、A和P值的多响应置换过程( 32 )，分析TRFLP指纹是否存在峰以及峰的相对丰度。焦标签序列的质量筛选，分箱进入操作分类单位( OTUs )，并进行分类分配(见在线补充)。在进行任何统计分析之前，计算每个样品的相对OTU丰度。主坐标分析和使用PERMANOVA和Bonferroni校正的成对比较用于比较样品组。用辛普森逆指数( 33 )评价细菌多样性。Ginkgo用来鉴定物种的存在或丰富程度是否可归因于特定的样品组( 34，35 )。使用假发现率截止值为0.05的qvality ( 36 )获得用于说明多个复合粒子的q值(即，OTUs的数目)。
2、结果
2.1 研究对象
与不吸烟组和吸烟对照组相比，金4组和CF组预测的FEV1 %和预测的FVC %降低。CF患者的年龄( 32.6±8.7，平均6sd )比接受肺移植的CF患者预期的其他组年轻(表1 )。肺的计算机断层摄影图像和冷冻肺切片切片的切面检查表明，在任何COPD患者中均不存在支气管扩张(金4 )。无法从现有信息中记录该组COPD患者(金4 )中胃食管反流的存在。有关患者群体的更多信息可在在线补充资料中找到。
2.2 QPCR
肺组织中细菌总丰度极低，接近QPCR检测的检出限。阴性对照组( n424 )的细菌总数平均为0～588个细胞，明显低于其他实验组( P 0.001 )。CF组的细菌总数高于其他四个实验组( P，0.001 )，每个样品的细菌总数在2，712 - 1，075，846个细胞之间。非吸烟组、吸烟组、金4组细菌总数无显著性差异( P > 0.05 )。0.05 )，其范围为每个样品20 - 1252个细胞。通过应用校正因子来解释污染细菌和样品中宿主细胞的数量，不吸烟组、吸烟组和金4组之间仍然没有显著差异(图1 )，其显示每1000个人细胞中有10至100个细菌细胞。相比之下，CF组肺组织中每1，000人细胞中的细菌数量要多三到四个数量级。
2.3 TRFLP
TRFLP分析确定四个阴性对照样品中的两个、八个金4样品中的七个以及所有其它样品产生足够的扩增子用于进一步分析。TRFLP结果采用非测量多维标度(图2 )表明，样品中的肺部细菌群落组成聚集成三个不同的组，对应于非吸烟者加吸烟者组、金4组和CF组，两个阴性对照样品与CF组聚集在一起。
来自多响应置换过程分析的t值，其中负数表示组之间的相似性较小，而正值表示更大的相似性( 37 )，表明这三个群落簇彼此显著不同(表2 )。产生TRFLP结果的阴性对照样品的数量不足以得出它们应该分开分组的结论。不吸烟组与吸烟组的T值表明细菌群落相似。A值，其中正数表示更好的组内一致性，负值小于( 38 )，弱负值表示两个组不够明显，不能分开。
2.4 Pyrotag Sequencing
巢式PCR对于从低细菌密度的样品中获得足够的扩增子是必要的。用巢式PCR和不巢式PCR对CF肺标本进行热标记分析，得到不可识别的群落组成( P。0.05 ) (参见在线补充资料中的图E1 )。因此，巢式PCR的结论是焦磷酸测序不改变偏好，并用于所有进一步的分析。
对总焦标签OTUs的主坐标分析揭示了四个不同的细菌群落簇(见图E2A )，这与TRFLP数据一致。所有六个阴性对照样品产生足够的扩增子用于焦标记分析，其细菌群落聚集为显色组，除了与CF组的一个样品聚集之外，对于CF组仅分析六个样品，因为测序运行中的其它两个点用于检查样品内重复性(数据未示出)。非吸烟组和吸烟组的群落聚集在一起，而金4组和CF组的群落各不相同。对于与阴性对照样品读数具有3 %或更大相似性的OTUs的亚牵引，排序趋势保持不变，其余三个样本之间的差异更大(见图E2B )。
对四个患者组之间的测序结果的成对比较(表3 )显示不吸烟者和吸烟者对照组没有不同。GOLD 4组和CF组与不吸烟组和吸烟组有显著性差异( P 0.05 )。在减去与阴性对照读数具有3 %或更大相似性的OTUs之后，比较结果没有改变(表3 )。
焦标记分析在肺样品中鉴定出大于1400个OTUs ( z97 %相似性水平)，其与阴性对照样品不同。前150名OTUs的列表可在在线补编中找到(见表E6 )。肺组织中细菌密度低的实验组(不吸烟组、吸烟组和金4组) (图1 )具有Simpson逆指数评估的最高发散度(图3 )。三组间差异无显著性( P > 0.05 )。0.05 )。相比之下，CF肺组织和阴性对照组的多样性低得多，这表明CF ( 24 )和阴性对照组中有少量生物体占优势。
在门一级，各实验组的群落组成大体相似，只有三个例外(图4 )。吸烟组的放线菌丰度显著高于其他各组( P 0.007 )。金4组和CF组的厚壁菌数量显著高于其余各组( P 0.003 )。对于金4组，厚壁菌的主要增加来自乳杆菌属(见图E3A )，并且在八个样品中的七个样品中一致观察到(数据未示出)。相比之下，在CF组中，厚壁菌的增加主要由链球菌属的高丰度引起(见图E3A )，但仅在八个样品中的一个样品中观察到(数据未显示)。CF和金4组含有大于5 %的伯克霍尔德菌属(见图E3B )，而其它样品组则不含有。
指示物种分析确定了52个与一个肺样品组相关的OTU，其P值小于0.05（见表E7），其中28个OTU对于GOLD 4组特异。 在所列的GOLD 4指标（见表E7）中，乳杆菌和类杆菌属各占25％，而伯克霍尔德氏菌占28个OTU的11％。 经过错误发现率校正后，28个中的4个与GOLD 4组（表4）保持显着的相关性，而与其他样本组相关的则没有显着性（见表E7）。 在这四个中，三个被分类为未知的乳杆菌种类，另一个OTU分类到未知的伯克霍尔德杆菌种类。 通过QPCR分析证实GOLD4组中的乳酸杆菌相对富集，证明其与pyrotag序列分析（见图E4）没有显着差异。
3、讨论
在本研究中检测的肺组织样本中检测到的细菌密度低于以前的基于BAL或保护支气管刷样本的研究报告的细菌密度（20,21,39）。 然而，这些以前的报告使用不同的方法来量化总细菌（20,21,39）。 在这项研究中发现的密度较低可归因于肺组织样本中较小的上皮表面区域，与通过洗涤或刷洗肺脏取样的上皮表面区域相比较。 此外，我们检测到的低细菌密度可能部分是由于从冷冻肺标本中取出的组织样本污染程度减少，而不是从被清洗的样本（20,21,39）或清洗过的样本（20,21） 肺表面。尽管与其他研究有所区别，但我们的结果证实了Hilty和同事（20）的结果显示，与吸烟者相比，非吸烟者和吸烟者对照组之间的总细菌数量没有差异。 此外，本研究中的TRFLP和pyrotag分析证实，与不吸烟者和吸烟者对照受试者相比，来自GOLD 4患者的肺组织中的细菌群落存在差异。 因此，独特的细菌群落与非常严重COPD患者的肺组织相关。
值得注意的是，根据Simpson反向指数，GOLD 4组的肺组织细菌多样性与非吸烟者和吸烟者对照组相同。 相比之下，CF肺的多样性要低得多和细菌密度更高，这与CF过程中少数细菌种类的扩张是一致的，并且与之前对CF的研究一致（40）。 虽然多样性测量的丰富度可能因PCR和序列错误而有偏差，但是我们关于这些群落的相对多样性的结论是有效的，因为这些群体具有相似的样本数量并且使用相同的方法进行比较。
在COPD非常严重的情况下，少数菌的相对丰度似乎有所转变，而没有任何一个处于支配地位。 这种观察并不支持以前的建议，即由于COPD病例（20）和更严重的COPD病例（20）出现少数优势属，疾病相比于健康吸烟者和不吸烟者，其生物多样性减少[20]。 我们研究中的GOLD 4患者的肺组织和另外两个患者的肺组织的对比结果可部分地由研究设计的差异来解释。 Hilty和同事分析了中度COPD患者的支气管刷，而Erb-Downward和同事分析了中，重度COPD患者BAL样本和组织。 此外，不平等和不足的样本量可能是一个问题。前者将5例中度COPD患者的样本与8例对照样本进行比较。 在后者中，将来自7名健康吸烟者和3名不吸烟者的BAL样品与4名COPD患者进行比较，其中两名患有轻度，一名患有中度，另一位患有严重COPD，其中前两位具有与大多数不吸烟者和吸烟者控制科目，而其他两个有很多的有限的多样性。
目前的结果与基于支气管刷和BAL的结果不同，因为它们可能反映实质组织（即气体交换的肺泡组织）中的微生物，而不是气道，因为90％的肺容积被实质占据，只有10％ 由非实质（即气道，血管和间质组织）（41）。 虽然不可能组织学检查使用的30mg组织，但是为了测量微生物组，我们能够检查附近的样本以确认实质是靠近样本区域的肺的主要组织学特征。 因此，通过刷和BAL获得的样本可能具有较好的气道内容采样机会。
我们的细菌群落组成结果也不同于这两个研究。 Huang和同事（22）从他们的研究中提供了一个可能的解释，说明COPD急性加重期患者肺微生物群中微生物多样性与插管长度相关的变化。他们发现，具有较高细菌群落多样性的个体也支持较高数量的厚壁菌，而细菌多样性较低的个体则具有较高的细菌数量（22）。 这与我们的研究结果是一致的，在严重COPD患者中（21），低细菌多样性可能导致变形杆菌门增加，更高的细菌多样性可能导致壁菌门增加。
由于本研究中用于分析肺部标本菌种的三种方法是基于容易污染的细菌16S rRNA的PCR扩增，所以包括阴性对照样品。 QPCR结果显示阴性对照样品中的细菌丰度显着低于肺样品中的细菌丰度。此外，TRFLP分析表明，与非吸烟者，吸烟者和GOLD 4组相比，阴性对照组人群中非常低的菌量不是由污染引起的。 此外，在pyrotag分析中的聚类证实，低细菌密度的肺样品含有细菌群落，这与阴性对照样本不同。 这两种不同的分析细菌多样性的方法提供了合理的证据，证明在肺样品中检测到的细菌不是由污染细菌引起的。 在这方面，值得注意的是，Hilty和同事（20），Erb-Downward和同事（21）在他们的研究中纳入阴性对照样本。
尽管特定的OTUs与非常严重的COPD显着相关，但是这些序列并没有与任何描述的物种密切相关，也不能用本研究中使用的分类学数据库来识别。 统计分析表明，厚壁菌门与这些COPD肺显着相关，并且Lactobacillus是与厚壁菌增加相关的主要属。 我们的研究还表明属于乳杆菌属单个物种的OTU也与非常严重的COPD显着相关，但是这些OTU再次与我们的分类学数据库中的已知序列无关。
乳酸杆菌属常见于胃肠道和生殖道（42-44）。 大多数在人体中鉴定的乳酸菌来源于食物[45]，并且已经在健康的非癌症对照组受试者的胃中鉴定出来，并且在胃癌患者中增加[46]。胃食管反流被认为是恶化加重的一个重要危险因素，是COPD频发急性加重期自我报告合并症之一（19,47-49）。 在肺切除手术过程中，乳酸菌可能通过胃食管反流或气管插管进入肺部。最近，已经表明，乳酸杆菌可以调节小鼠对甲型流感病毒的免疫应答，并且该属的丧失减弱了这种免疫应答（50）。 乳酸杆菌在肺组织内的存在增加可能是由于对诸如流感的刺激的炎症性调节的结果，并且导致与小气道相关的第三级淋巴滤泡的形成。这可以归因于作为目标的乳酸菌或作为免疫调节剂并帮助炎症反应。 这些细菌是否留在肺部并调节炎症反应或成为驱动人类肺部先天性和适应性免疫反应的抗原靶点还有待确定。
指示种分析也显示，伯克霍尔德氏菌OTU与GOLD 4组显着相关。 尽管Burkholderia属，特别是洋葱伯克霍尔德菌与CF疾病有关（51），但它通常与COPD无关。由于OTU与所使用的数据库中的任何已知物种没有很好的比较，所以不能对这种未确定的细菌在疾病中可能发挥的作用做出明确的结论。 本研究的局限性在于没有中度COPD（黄金2）和严重COPD（黄金3）组。 因此，将我们的发现推断到这两个群体可能是不可能的。 GOLD 4组乳杆菌和伯克霍尔德杆菌的出现可以是突然发生的或者是逐渐进行的，随着疾病严重程度加剧，两个属的频率更高。
这项研究的结果证实，使用目前可用的分子技术，可以在肺组织中检测到低数量的细菌。 尽管在不吸烟，吸烟或GOLD 4受试者的肺部标本中检测到的总数没有差异，但来自不吸烟和吸烟对象的标本明显具有与非常严重COPD受试者的标本不同的细菌组成。无论这些生物体是由宿主免疫系统作为靶标还是在帮助调节反应方面，都需要在进一步确定它们刺激或刺激的免疫反应是否驱动组织反应导致COPD中气流受限的病变之前进行确定。 然而，最近关于细菌微生物组和免疫反应的研究（50,52）强烈地表明，细菌可以在从病毒感染到关节炎的广泛疾病中指导免疫应答和炎症过程中发挥积极的作用。
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