囊性纤维化肺中微生物群落的空间分布

微生物学习笔记

Posted by zd200572 on February 6, 2018

摘要

囊性纤维化( CF )是一种常见的致死性遗传性疾病,其死亡率最常由肺部微生物感染引起。对CF相关微生物群落的非培养研究表明,CF气道中的微生物多样性远高于单独培养所建议的。然而,这些研究依赖于间接的方法对CF肺进行采样,例如祛痰和支气管肺泡灌洗( BAL )。在这里,我们用标签扩增子焦磷酸测序来表征CF肺解剖上不同区域的组织切片中微生物群落的多样性。肺不同区域的微生物群落差异显著,所调查解剖区域的微生物群落共有的类群较少。我们的结果表明CF肺部感染不仅是多微生物的,而且是空间异质性的,这表明针对痰或BAL样本中优势人群的治疗方案可能对肺部某些区域的感染无效。

囊性纤维化( CF )是高加索人群中最常见的遗传性疾病之一,影响到全世界70 000多人(囊性纤维化基金会,2011年)。CF的大部分死亡率是由于肺部微生物感染导致最终呼吸衰竭(囊性纤维化基金会,2008年)。铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌和Burkholderia cepacia是成人CF患者常见的致病菌,但最近的研究表明CF气道中的微生物群落差异很大( Armougom等)。2009年;罗杰斯等人。2009年;考克斯等人。2010年;古斯等人。2011年)。支气管肺泡灌洗( BAL )和au - topsy标本的培养分析表明,CF肺不同空间区域的微生物种群差异显著( Smith等)。1998年;古铁雷斯等人。2001年;吉尔克里斯特等人。2011年)。Erb-Downward等最近使用非培养方法证明了COPD患者离体肺组织中微生物群落的空间异质性,但尚未对CF患者进行类似研究。在这里,我们进行了第一个不依赖培养的直接从CF肺组织分离微生物群落特征。

为了表征微生物群落,我们从移植病人的离体肺中获取了肺组织切片,以及尸检后死亡CF病人的组织切片和气管粘液塞。患者临床资料见补充资料和方法。通过高通量条形码扩增子序列分析16S rDNA基因,并使用QIIME流程(补充材料和方法) ( Caporaso等)分析微生物群落。2010年)。

离体肺的微生物群落丰富度大于死后肺。在97 %的相似性下,有498个操作分类单元( OTUs )对应于植入前肺中的20门,相比之下,106个OTUs包括死后肺中的9门(图1;补充表1和2 )。稀释曲线和Chao1估计值表明,外植体肺叶的预期OTU丰度高出一个数量级(补充图1;补充表1)。两组肺部均表现出晚期CF呼吸系统疾病的病理特征,但出厂肺部保留了一些正常组织的区域,而死后肺部则显示所有区域的外周气道几乎完全破坏(Supplemental 材料和方法)。这与CF和COPD微生物多样性的研究已经证明了微生物多样性与疾病严重程度之间的负相关关系(Erb-Downward等,2011; van der Gast等,2011)相关。

在两组肺中的微生物群落由少量高度丰富的分类群占优势。 在家族层面上,被归类为Comomonadaceae的一个OTU在出厂肺中的每个叶中占总细菌多样性的~68%(图1;补充表2)。先前已经在CF呼吸样本中鉴定了Comomonadaceae,但是普遍不认为是CF病原(Coenye等,2002; Guss等,2011)。对应于黄杆菌科的OTU (14-23%),Diaphorobacter sp。 (3-5%)和Novosphingobium sp。 (2-4%)也无处不在。在死后肺中,铜绿假单胞菌( BLASTn,100 %同一性,e - value O1 10 - 180 )是最丰富的分类单元,在每个叶中包含51 - 94 %的序列,在气管样品中包含99 %。其他OTUs普遍存在,但在低丰度( O3 % )中发现,包括分类为德氏乳杆菌(Lactobacillus delbruckii),肠球菌属(Enterococcus sp。),梭菌属细菌(Cloaci-bacterium sp) 和Diaphorobacter sp。

当使用加权均匀距离度量来比较群落时,植入前肺中的微生物群落比死后肺中的微生物群落更相似(图2;补充表3 )。死后肺叶之间的平均距离大于植入前肺叶之间的平均距离,反映了更多的群落多样性(补充表3 )。死后肺中所有叶共有的OTUs不到1 %,而~60 %的OTUs仅在一个叶中鉴定出 (补充表2 )。几种独特的OTUs对应于潜在的CF病原体,例如黄单胞菌(仅左上叶)和乳糜杆菌( Harrison,2007;利普马,2010年)。在外植体肺中,约有3%的OTUs被所有叶片共享,但是大部分不共享的OTUs为低丰度(1%)。这些可能是短暂的CF的微生物种群,之前被描述为核心CF微生物van der Gast等人。(2011)。

基于Unifrac距离的平均连锁(UMPGA)聚类聚类产生对应于外植体和死后肺的两个主要聚类以及每组肺内的几个较小聚类(图2 )。在外植体肺中,微生物群落形成两个显著不同的簇( Bonferroni的校正P值0.05 ),由XIPE测定,其利用非参数统计来比较群落分布( Rodri - guez - Brito等)。2006年)。一个簇包含RUL和Lingula,另一个包含所有其他叶。 这种聚类主要是由于主要OTUs的丰度差异,包括黄杆菌科(Flavobacteriaceae spp)。 在尸体肺部,社区与LLL形成了两个群组(图2)。由于叶绿体序列丰富,可能代表植物DNA的吸入(Bousbia et al。,2010)。 吸入可能发生在患者在死亡前3周插管,如Bousbia等的研究表明在接受机械通气的患者中证明植物DNA在肺中持续数周。气管、RML和RLL群落的聚集可能表明吸入的气管粘液的重力依赖性沉积,因为气管内容物预计将在RLL和/或RML中沉淀( Bittar,2002 )。尽管观察到聚集,气管群落与RML和RLL显著不同,包含在肺中未发现的7种OTUs,包括普雷夫氏菌属。是口腔微生物群落的共同组成部分。

我们的结果表明囊性纤维化肺中的微生物群落是空间异质性的。尸检样本的使用是本研究的一个注意事项,因为微生物群落组成可能受死亡时吸入的影响。尽管存在这种限制,但与其他采样方法相比,直接采样肺组织提供了更具体的微生物群特征,这可能由于缺乏空间分辨率而歪曲CF肺疾病的真实性质。空间异质性可能比16S测序所能解决的范围更广,包括微生物生物量的区域差异、抗生素抗性和高度丰富和无处不在的群体的菌株水平差异。囊性纤维化的治疗策略依赖于针对具有已知抗生素抗性的特定物种的微生物的抗生素,可能仅对特定区域或肺微环境中的病原微生物有效。

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