RNA-seq分析-学习笔记
从南京图书馆借了本《生物信息学最佳实践》（冉隆科. 生物信息学最佳实践[M]. 科学出版社, 2016.），前几章的笔记记在了纸质笔记本上，感觉还是电子版的可以更便携，刚好一本笔记本记完了，剩下的简略的笔记就记在这里了。
一、分析流程(pipeline)
测序(.fastq)——Bowtie/TopHat(.fa)(read alignment)——Cufflinks(.gtf)(transcript compilation)——cuffmerge(gene identification)——Cuffdiff(differential expression)——CummRbund(visualization)
1、数据准备
2、软件准备
a、TopHat（短读段映射）
b、Bowtie（一个超快的短读段比对工具）
c、Cufflinks（转录组装配）
d、CummeRbund（R的bioconductor包进行差异可视化表达）
e、Samtools(读段识别工具)
3、分析过程
a、构建索引文件
bowtie2-build genome-fasta-file index-name
b、比对
tophat [options] index-base reads1 reads2
-p:CPU线程数
–solesa-quals
–library-type:链特异性library type（illumia fr-untrusted）
DrZv9.66 #参考基因索引文件前辍
d、转录组重建
cufflinks [options]* aligned_reads.sam/bam
-g :gff格式注释文件
-b:较正算法
-u:初步评估
e、合并装配后的转录本文件
cuffmerge -p 4 -g annotation/DrZv9.66_chr12.gtf -s genome/Zv9.fa assemblies.txt
f、识别新的转录本
上步文本中每行包含一个注释字段（class_node）
g、差异表达分析
cuffdiff
-L:不同样品条件
-T：不同时间序列条件
h、使用cummeRbund包进行差异表达分析
‘>library(cummeRbund)#载入包
cuff = readCufflinks(‘diff_out’)#导入cuffdiff结果文件夹中diff_out
csDensity(genes(cuff))#表达值分布
csScatter(genes(cuff), ZV9_2cells’, ‘ZV9-6h’)#散点图
csScatterMatrix(genes(cuff))#检查单个密度和与之配对的散点图
csVolcanoMatrix(genes(cuff)), ‘ZV9_2cells’, ‘ZV9-6h’)#火山图
gene_diff_data=diffData(genes(cuff))#基因水平的表达数据
nrow(gene_diff_data)#统计总的表达基因数
sig_gene_data = subset(gene_diff_data, (significant ==’yes’))#显著表达差异的基因数
nrow(sig_gene_data)
write.table(sig_gene_data, ‘sig_diff_genes.txt’, sep = ‘\t’, row.names=FALSE, quote =F)#输出差异到文件中
’
