原文来自:Segal L N, Blaser M J. A Brave New World: The Lung Microbiota in an Era of Change[J]. Annals of the American Thoracic Society, 2014, 11 Suppl 1(Supplement_1):S21.
摘要
独立于培养的技术的发展改变了我们对人类细胞如何与更多的人体微生物的相互作用的理解。作为这场革命的一部分，数据正越来越多地挑战健康中的旧教条，即肺粘膜是无菌的。为了了解肺微生物组如何在人体健康中发挥作用，我们对肺微生物组研究的主要问题进行了探讨：(1)肺微生物群是无菌的吗？(2)肺内是否有独特的核心微生物群？(3)微生物种群动态如何？(4)肺免疫反应如何影响微生物组成？(5)肠道微生物群的肠道免疫反应是否影响肺部？从出生开始，我们就面临不断的微生物挑战，这些挑战塑造了我们的微生物群。在我们不断变化的环境中，肠道微生物群的扰动影响着人类的健康和疾病。由于抗生素的广泛使用，以前居住在我们体内的古老微生物正在消失，例如，胃中的幽门螺杆菌。动物模型显示，早期接触抗生素会对发育产生影响。这种改变后的微生物群对肺反应的潜在影响，对今后的研究至关重要。
随着与培养无关的技术的进步，人们对在肺中寻找微生物又产生了新的兴趣。新的观察正在挑战旧的教条，即在健康中，肺粘膜是无菌的(1，2)。随着测序技术和生物信息学分析技术的对数发展，肺微生物学的研究越来越受到人们的关注。不断变化的研究环境代表了解决人类健康中长期存在的重要问题的一个新的前沿。
肺微生物学研究中的几个关键问题
1.肺是无菌的吗？
多年来，这个问题似乎与此无关，因为没能使用培养依赖技术描述健康肺中的居住细菌。在各种因素中，肺部可培养细菌负担低，采样过程中上呼吸道微生物受到污染，以及挑剔的细菌造成了肺无菌的假设(3，4)。随着培养无关技术的使用，现在有大量的文献证明在正常人的下气道中存在细菌(5-8)。16S核糖体RNA(RRNA)基因的定量PCR结果表明，下气道的细菌负担小于上气道。然而，在健康受试者的肺中已经描述了一种多样化的微生物群。普遍发现肺内常见的是常在口腔(5，8-11)存在的分类。由于下气道的取样通常由支气管镜检查进行，因此对于这些微生物是否代表上气道微生物区系和/或微抽吸物的有争议(图1)。在随后的样品中观察到的细菌负荷的下降被认为是支持一种不可能携带的信号效应(5)。然而，在所有的研究中，这并不是一致的，这表明技术异质性很强(8)。相反，众所周知，微量吸入（菌）在健康人中是一种普遍现象，在一些呼吸系统疾病状态(12-14)中，这种现象更加严重。正常肺中细菌负荷低的观点支持了这样的观点：虽然健康的肺具有清除微生物的能力，但肺粘膜中仍存在残留的微生物。清除微生物的能力在肺部疾病中也通常受到损害(15，16)。携带和微吸入都能不同程度地促进下气道微生物群与上呼吸道类群的富集。支气管镜技术，能够更好地减少携带的贡献是必要的。此外，考虑到大多数肺样本的细菌负担较低，背景高的微生物群信号通常会干扰肺微生物群数据的解释(8)。新的基于数学建模的计算背景减法技术，如中性模型、单边异常值检验和SourceTracker，可能解释了携带，并有可能识别真正的肺分类群(7，17，18)。
解决这一问题的一个难题是确定肺微生物群的生存能力。传统上，文化技术已经被用来解决这个问题。应用16S rRNA PCR技术，目前健康肺的肺微生物学数据可能仅限于细菌DNA片段(5-9、17、19、20)。鉴于现有的数据和强大的高通量测序技术的高灵敏度，我们可能还没有准备好回答这个问题。然而，这一限制并不能使确定主要由死细菌组成的微生物群的特性的相关性失效：分类成分可能会从不活的细菌中重新获得一种由各种微生物相关分子模式(MAMPs)组成的特定的、不具有免疫调节作用的微生物群。
2.有核心微生物群吗？
肺部的生物是独一无二的吗？一个具有挑战性的观察是，下气道微生物组比另一个人的肺微生物组更类似于同一个体的上气道微生物组(17)。虽然这部分原因可以解释，如果上呼吸道迁移发生，大多数数据表明，在健康的个体(7-9，19)有很大的差异(7-9，19)。因此，确定不同个体之间的重叠程度是非常重要的。从概念上讲，寻找共同的核心符合这样的假设，即肺环境给肺部的微生物居民带来选择压力。例如，数据显示正常人肺内存在有Tropheryma whipplei(6)。重要的是，当每样本500个序列时，在上呼吸道标本中没有发现这种微生物。这一观察表明，Tropheryma whipplei通过血行扩张或微吸入到达肺。在这两种情况下，数据表明对于T.wapplei，肺是真正的合适的位置。肺的这种取向可能解释了为什么在下气道和气管内易患上气道病变的原因。有证据表明，这种微生物对下气道的定植作用在免疫功能上得到了增强，进一步表明宿主与微生物的相互作用处于动态状态。因此，我们假设微生物组分中的两个组分可能引起协同宿主反应：一个是独特的同源类群和肺环境中的一个特殊生态位，另一个是MAMPs发挥免疫调节作用的部分。肺微生物学的这两个组成部分值得进一步探讨。
3.肺微生物群的动态是什么？
随着抗生素和抗炎药的广泛应用，对肺部微生物的影响是巨大的。对肺微生物群落的干扰可以导致没有变化(抗性)、可能恢复到原来组成的改变的微生物群(复原力)、功能上可能相似的永久改变的微生物群(功能冗余)，也可能导致在组成和功能上永久改变的微生物群。这些动态变化可能与我们理解肺健康和疾病的发病机制有关。在肺中，微吸入通常是一种重复现象(12)。正如前面所讨论的，这可能解释了口腔分类群如Prevotella和Veillonella在下气道微生物群中的频繁出现。下气道这种周期性暴露于上气道的微生物是一种重要的播撒机制，可能在下气道微生物的选择中起着重要的作用。作为这种选择压力的一个例子，肺炎链球菌是上呼吸道和下呼吸道微生物的一个次要组成部分，它导致了社区获得性细菌性肺炎的一半以上。此外，下气道微生物区系的动态变化可能会引起与肺损伤的发展和/或免疫抑制状态(如囊性BroSis、支气管扩张、酗酒或HIV感染)相关的细菌趋向性的改变。几个例子的动态变化的气道微生物已被提出，以实质上影响疾病的进展。在慢性阻塞性肺疾病中，加重通常是由新菌株的获得引起的，并伴随着炎症的增加和肺功能的下降(21)。在CF中，细菌多样性的变化与疾病的进展和随后与病原体的定植有关(22)。CF气道微生物多样性随发病阶段(22，23)而明显降低。此外，在恶化事件发生前气道微生物区系的组成可能与确定参与恶化的微生物成分有关(24)。下气道微生物群多样性(Shannon多样性指数)和恶化前的假单胞菌为主的微生物群可以预测恶化期间微生物群结构的较大变化。这些数据表明，从“健康”到“不健康”的气道微生物群的动态变化会导致病原体富集和宿主伤害所必需的敏感微生物环境。研究肺部微生物群的动态变化将需要前瞻性和纵向研究。
4.肺粘膜炎症的肺微生物群提示是什么 ？
我们的细胞和我们居住的微生物之间的关系不是偶然的，但很可能是经过长时间的进化？(25)。肠道微生物在形成粘膜免疫系统中的作用是很清楚的(26，27)。肠道微生物区系的组成调节小肠固有层中辅助性T型17细胞与T调节细胞(Th17：Treg平衡)之间的平衡(26)。与常规定殖动物相比，无菌小鼠免疫发育不良，CD 41和CD 81 T细胞(28，29)较少。然而，肠道微生物群与肠粘膜之间的这种共生依赖于屏障机制，这种机制排除了大多数细菌，防止细菌入侵，并导致对细菌产品持续暴露的耐受性。这些重要机制的丧失可能导致细菌入侵和慢性炎症过程，例如在炎症性肠病(30)。在肺组织中，关于气道微生物组对免疫成熟的影响以及下气道出现的耐受类型，人们对此知之甚少，这可能与共生相互作用有关。来自欧洲两项大型研究的数据表明，特定的环境暴露可以保护哮喘和过敏性哮喘的发展(31，32)。利用分子技术评估与农场有关的细菌或真菌在两个队列中的暴露模式(Parsifal：预防与农业和人的生活方式有关的儿童过敏危险因素；加芙列拉：欧洲共同体查明哮喘的遗传和环境原因的多学科研究[Gabriel]高级研究)进一步将某些环境微生物定性为对哮喘的保护(33)。微生物产品的环境暴露量增加已被证明是防止过敏的保护因素(34，35)。这种微生物暴露发生在幼儿期，由分娩方式、农场居住或抗生素使用决定，所有这些都被证明是赋予保护或反过来增加日后患哮喘的风险的因素(33、36-40)。这重新引起了人们对“卫生假说”的兴趣，该假说指出，改变饮食、改善卫生条件和增加抗生素的使用，可以防止接触早期充分的免疫成熟所需的微生物。这会导致T细胞亚群失衡，例如Treg细胞紊乱，这可能会导致免疫疾病。
在无症状成人中，肺微生物组与口腔特征性组分的增加，增加了炎症细胞和呼出的一氧化氮，提示气道微生物组存在特异性的敏感性反应(8)。虽然微生物区系在刺激宿主免疫反应方面的作用似乎很明显，但目前尚不清楚观察到的关联是否是因果关系。此外，这很可能是双向关联，气道微生物区系的特征也由宿主免疫反应决定。通过观察发现，免疫不全的受试者有一个富含Tropheryma whipplei的肺微生物群，抗逆转录病毒治疗后其相对丰度也随之降低(6)。气道微生物组的其他潜在作用可能与代谢过程(如药物代谢)、控制表面活性剂的产生或气体交换有关，需要对这些领域进行更多的研究。
6.肠道微生物-粘膜相互作用与肺之间是否存在交叉对话？
肠道分析表明，肠道微生物组成与免疫系统的发育有关。此外，越来越多的证据表明，胃肠道粘膜是微生物与宿主相互作用的主要部位，在远端粘膜部位的免疫反应中起着重要作用。几个调查支持肠道微生物-粘膜相互作用与肺之间的交互的概念。在小鼠中，胃肠微生物群的破坏导致气道过敏反应异常(41，42)。在其他小鼠模型中，口服各种菌株的乳酸菌和摄入细菌产品，调节过敏性肺脏(43-45)。更重要的是，有证据表明，胃被幽门螺杆菌感染的儿童患儿童哮喘的可能性比非携带者的儿童低40~60%(46)。同样，婴儿肠道微生物多样性的减少与变应性鼻炎和外周血嗜酸性粒细胞增多有关(47)。综合起来，这些数据支持了肠道微生物影响全身免疫系统，从而影响肺粘膜的假设。另外，肠道微生物区系的变化也可能使口咽微生物区系发生变化，这可能直接影响肺微生物区系和宿主通过微吸入术产生的免疫反应。最终，肠粘膜和肺粘膜都可能是一个的系统级的器官，并共享免疫监视和宿主反应形成的生理功能，需要进一步研究，以确定与这两个粘膜位点相关的免疫学机制。
人类微生物群正在变化的证据，以及潜在的后果
古老的，垂直的
自从大约五亿年前动物在这个星球上出现以来，动物就一直有微生物在它们身上定居。这些微生物生活在它们的宿主内和宿主上的特殊的生态位中，并且在寄主生命中的相当大一部分时间内往往是持续的。重要的是，这些居住微生物中很大一部分可以被认为是宿主的正常微生物群，可以从母亲垂直传播到后代(48)。数百万多年来，这种情况一直存在，包括所有哺乳动物，如人类。
猛烈抨击
自二战以来，许多重要疾病的发病率急剧上升，包括哮喘、1型糖尿病和肥胖症(49)。由于美国(图2A)和其他发达国家的流行病不断增加，我们的研究工作集中在肥胖问题上。
出生
微生物群从母亲转移到人类婴儿的过程正面临着前所未有的限制。首先，可以公平地说，我们不知道这一问题的严重性，无论这些限制是大的还是小的，但它们是广泛的。在美国，大约有一半的孕妇在怀孕期间服用抗生素。这些会导致微生物区系在转移到后代之前的灭绝。尤其是在出生前，例如，为了防止B组链球菌感染，抗生素也可能存在于婴儿的血液和母乳中。这将对抗生素抗药性的生物创造更多的选择，并从接生的手改变婴儿的环境。此外，在美国出生的婴儿中，约有三分之一是通过剖腹产分娩的。在巴西和中国城市，碳截止率接近50%，甚至在发展中国家，如厄瓜多尔和伊朗，这一比率也超过了40%。剖腹产的一个后果是婴儿不再穿过阴道，也没有阴道微生物(50)。因此，剖腹产和阴道分娩的婴儿在出生后的各个部位–皮肤、口腔和肠道–的初始微生物区系就有不同(48)。微生物群何时以及能不能完全回到正常的发育途径还不清楚。
数据表明，通过早期暴露于致病菌(51，52)中，能够产生平衡的免疫反应，这是维持健康气道的基础。莫拉氏菌、卡他莫拉菌和嗜血杆菌在早期阶段在上气道定殖与Th2和Th17有着密切的联系，它们可能在抵抗Th1反应的同时，招募和激活嗜酸性粒细胞和中性粒细胞(52)。此外，早期呼吸道合胞病毒感染会影响调节性T细胞表型可塑性，降低T细胞的抑制能力，使宿主在以后的生命中更容易患哮喘(53)。这种呼吸道暴露于早期的病原微生物可能有助于慢性哮喘的发展和增加哮喘的风险。
早期未能建立健康的肠道微生物群也会改变免疫系统的成熟，促进成年期过敏反应的改变(54，55)。在小鼠模型中，口服万古霉素会引起更严重的过敏反应，而链霉素则不会引起过敏反应，这表明微生物成成可以在过敏敏感(56)中起作用。在一种过敏性气道疾病的小鼠模型中，无菌小鼠比传统的对照组表现出更严重的疾病，这种效应可以通过常规微生物群的再殖化来改善(57)。当饮用水中使用抗生素或抗生素-真菌组合(42，58)引起肠道微生物群紊乱时，也发现了类似的结果。早期微生物定植调节黏膜不变的自然杀伤T细胞耐受性，并能在成年后期影响黏膜部位的免疫反应(59)。调节性T细胞介导的耐受性机制可能会在肠道微生物种群，如梭菌丢失或改变(27，56)时被破坏。因此，肠道定植在生命早期对指导免疫发育和维持整个生命(60，61)的粘膜稳态起着重要的作用。
对遗传微生物的攻击并不是在出生时就结束的。幼儿经常服用抗生素。很明显，抗生素的大量滥用，特别是上呼吸道感染，包括中耳炎。在减少这一问题方面有了一些小的改进；然而，疾病控制和预防中心的数据(62)表明，儿童在每两年的生命中平均都接受了一个疗程以上的抗生素(表1)。根据美国2010的流行数据推断，当儿童达到2岁时，平均每个孩子可能正在接受近3个疗程的抗生素，10岁时接受11个疗程，20岁时接受17个疗程。这些数据与其他发达国家有限的研究相一致(63-65)。
事实上，抗生素在美国的使用显示了重要的地区差异(图2B)。2010，美国为门诊病人开了二亿五千八百万个疗程的抗生素，相当于每1000人833个疗程。在东北部和中西部，这一比率与全国平均水平相似，但西部(638/1000人)比南部(936/1000人)低约50%。由于南方人和西方人细菌传染病的发病率和严重程度可能在50%之前没有差别，抗生素使用的差异可能表明在医疗习惯和实践上的差异。有趣的是，2010年肥胖流行率和抗生素使用的地图显示出惊人的相似之处。这样的观察提出了这样一个假设，即抗生素的过量使用是导致当前肥胖流行的原因之一。
对农场的影响
这一观点的支持来源于从20世纪40年代开始的农场观察。当时，据了解，用低剂量抗生素喂养牲畜(我们简称为STAT)，可促进农场动物的生长(66，67)。有三项重要观察：
- 1.STAT对从鸡到牛的各种牲畜都有效，代表了脊椎动物进化的广泛范围。
- 2.这种作用可以用广泛的抗菌药物，不管化学结构、药物类阳离子、作用机制或目标生物。抗病毒和抗真菌药物无效。
- 3.开始的年龄越小，STAT的效果就越大。
这些最后的观察表明，抗生素正在影响动物的发育。因此，我们试图在小鼠模型(68)中解决这个问题。
小鼠模型
最初的工作集中在C57/BL6小鼠身上。在STAT模型中向小鼠提供多种抗生素，表明每种试验方案都改变了小鼠的脂肪发育，以及早期骨骼发育(68)。对微生物区系的研究表明，与短链脂肪酸合成有关的组成和基因丰度发生了变化，而且肝脏中有证据表明，与中间碳水化合物代谢和脂质生产和运输有关的基因的表达发生了广泛的变化。目前正在进行的工作从暴露窗口、饮食干预和抗生素干预的综合效应等方面对无污染环境进行了改进和扩展。这些研究为探索早期抗生素暴露在宿主发育中的作用提供了一个模型系统，并可能为肥胖流行的病因提供线索。
对肺的影响
抗生素的广泛应用是否对肺部微生物群的形成和动态有影响？在这一点上，很明显，我们只是不知道。抗生素可以通过其选择性作用直接影响肺部微生物群，也可以通过对肠道微生物群及其下游免疫功能的影响间接影响肺部微生物群。我们的“其他”基因组，正如人类微生物群被认为的，正面临着一个由生活方式、饮食和抗生素使用引起的重大变化的时代。利用不依赖于培养的16 SrRNA和元组学方法为我们理解肺作为一个独特的粘膜生态位暴露在复杂的微生物环境中提供了一个新的视角。我们只是在了解与胃肠道微生物群和气道有关的联系，以及人类微生物群的免疫学后果。现代微生物环境的变化和技术发展的结合，使人们能够理解人类的微生物群，这为探索在这个美好的新世界中的疾病机制提供了一个独特的机会。
