摘要
- 原理:在慢性阻塞性肺疾病( COPD )中，人肺中相对较少但多样的微生物群可能变得不那么多样。本文探讨了该微生物群与肺气肿组织破坏、终末细支气管数目、浸润性炎性细胞和宿主基因表达的关系。
- 方法：不依赖培养的焦磷酸测序的微生物分析法从5例COPD患者（慢性阻塞性肺疾病[GOLD] 4期全球倡议）共40个样品和4例供体（对照组）28个样品的细菌16S核糖体DNA的V3–V5区检查。另一个方法是基于V1–V3区是用来验证结果。肺组织样品中微生物与微CT，浸润的炎症细胞的定量组织学测定，与宿主基因的表达等结果相比。
- 测量和主要结果：发现10个OTUs足以区分对照组和GOLD 4期肺组织，其中包括已知的病原体，如流感嗜血杆菌（Haemophilus influenzae）。 我们还观察到与肺气肿破坏，细支气管和肺泡组织重塑以及CD41T细胞浸润相关的微生物多样性下降。 特定的OTUs也与嗜中性粒细胞，嗜酸性粒细胞和B细胞浸润有关（P <0.05）。 859个基因和235个基因表达谱的的富集或减少分别与Firmicutes和Proteobacteria相关联(错误的发现率截止值小于0.1）。
- 结论：这些结果支持这样的假设，即宿主对肺微生物组内的微生物有免疫应答，这似乎对COPD的发病机制有贡献。
慢性阻塞性肺疾病（COPD）是一种进行性衰弱性肺病，伴有多种并发症，影响全球超过2亿人，每年造成约300万人死亡（1）。虽然导致COPD的发病机制与宿主固有的进行性气流受限的小气道阻塞和肺泡破坏和和适应性炎症免疫反应( 2 - 4 )相关，但驱动这种反应的抗原仍不清楚。根据弗莱彻和同事们进行的一项前瞻性纵向研究，这个英国的团队提出了，吸烟损害了宿主的反应，允许导致慢性支气管炎和降低FEV1的有机体的下呼吸道感染和下呼吸道感染的假说（5）。这项研究表明，许多慢性支气管炎患者在没有出现气流受限，而另有许多人没有慢性支气管炎（5, 6）的情况下出现严重气道阻塞。COPD急性加重期患者常出现新的菌株（可以从痰中和保护支气管刷检中分离），这让塞西，墨菲和他的同事对细菌在COPD的发病机制中可能发挥的作用重新有了兴趣的细菌（7）。此外，赫斯特和同事扩展了这些观察结果，显示同一个体中COPD的频繁恶化与COPD导致肺功能下降的加速率有关（8）。
细菌鉴定和群落分析等不依赖培养的的技术的应用，导致了人类的胃肠道和泌尿生殖道，以及皮肤、口腔、上呼吸道微生物群落的发现，以及认识到和我们一起生活的身上庞大而复杂的微生物组。（9–12）。相比之下，长期以来的观点认为，肺部在喉下是无菌的，直到Hilty和其同事（13）通过分析支气管刷子中的微生物组和人类肺部的冲洗液，用这些技术来挑战这个假设。他们的新数据表明，哮喘和COPD患者的下呼吸道部位含有一种微生物组，其变得不那么多样化，并与潜在病原体的出现有关（13）。这些结果被批评为由于支气管刷洗污染和通过上呼吸道进行清洗而产生的人为因素。Erb-Downward及其同事（14）和Sze及其同事（15）在研究中反驳了这种批评，这些研究通过刷缺少上呼吸道的移植肺的气道获得的样本中的人肺微生物组， 或者迅速冻结移植的肺固体，使外周肺样本被移除而不干扰中央气道（15）。本本报告通过检查与肺表面肺气肿破坏有关的微生物组并提供初步证据表明这种破坏与对该微生物组的宿主免疫应答的发展相关联，从而扩展了这些观察结果。
1.方法
1.1 知情同意
知情同意书直接来自接受肺移植的患者作为非常严重COPD的治疗，或从最近的器官捐献者的亲属那里获得，他们同意如果认为不适合移植，可以释放肺作为对照。 获得同意的条件由各参与机构的适当委员会批准（20,21），机构之间的标本运输符合美国“健康保险流通与责任法案”。
1.2 标本制备
以前的出版物（20-22）和在线增补中详细描述了标本制备。 简而言之，将来自GOLD4期COPD患者和四只供体（对照）肺的5个移植肺用空气充分充气至30cmH2O的经肺压力，然后放气并保持在10cm H2O的经肺压力下，同时将冷冻的固体 液氮蒸气。 这些肺标本在干冰上保持冷冻，同时进行容积式多层螺旋CT扫描，同时将标本从肺尖到基部切成连续的2厘米厚的横切片。 对于下面概述的每个研究，从每个切片中取出四个肺组织核心的簇。
1.3微生物分析
Ward，Schloss及其同事（23,24）充分描述了方案1的流程，并基于细菌16S核糖体RNA（rRNA）基因的V3-V5区域的降落PCR扩增以及pyrotag测序 根据低生物量方案（14,25-27），在密歇根大学（Ann Arbor，MI）微生物群测序设施中完成扩增的DNA。 用于分析细菌16S核糖体DNA的方案2的管道在我们以前的出版物（4,15,20,21）和在线补充中有充分的描述。 Protocol 2在加拿大温哥华开发，基于16S rRNA基因的V1-V3区域的巢式PCR扩增和Genome Quebec（Montreal，QC，Canada）扩增DNA的pyrotag测序（15）。 它被用作独立的方法来确认从方案1获得的微生物组结果。
- 微生物多样性。 微生物多样性评估为H = EH3lnS，其中H是香农多样性指数，EH代表样品中OTU群落的均匀度，lnS代表OTU丰度（或不同OTU数量）的自然对数。 通过成对Bray-Curtis差异的主成分分析（PCA）显示对照和COPD肺样品的细菌群落组成之间的差异，并通过置换多变量分析方差（PERMANOVA）（28）进行测试。 在微生物组分析中使用的原始数据可以在Data Dryad根据以下DOI：10.5061 / dryad.2.p66n找到。
- 肺气肿破坏。在每个肺样品中评估肺气肿破坏为SA = 4 3 V / Lm，其中SA是在每个采样部位除去的肺组织核心的内表面积，V是组织核心中除去的肺的总体积 来自肺，Lm是平均线性截距。
- 炎性免疫细胞的浸润。 通过对多形核白细胞占据的细支气管和肺泡组织的体积分数（Vv）进行点计数来估计炎性免疫细胞向组织中的浸润;巨噬细胞; 和CD41，CD81和B淋巴细胞在来自组织伴随核心的适当染色的组织学切片上，并将结果与来自肺移植治疗的患者和其对照的肺的微型计算机断层扫描（microCT）的结果进行比较。
- 基因表达谱分析。详细的方法可以在在线补充和先前发表的文章（22）中找到。 这些基因表达数据可以通过基因表达综合（GEO）获得，登录号为GSE27597。
1.4 统计
使用线性混合效应模型来比较从肺表面积测量评估的OTU丰度与肺气肿破坏，以及宿主对该组织破坏的响应。这些是通过炎性免疫细胞占据的组织Vv或基因表达谱分析研究获得的，该组织切片分离的组织切片分离的组织切片非常靠近组织切片。线性混合效应模型允许校正肺部高度和每个肺切片内样品的位置（22）。使用DAVID（注释，可视化和集成发现数据库; 29）进一步分析基因表达途径。
只有与至少一个Vv或microCT测量值具有显着相关性的门和家族与宿主基因表达相比较。如果30％以上的样本未检测到门或科，则将数据转换为分类变量（正值或负值），然后使用线性混合效应模型进行分析。为了确定最有可能推动与门相关的OTU，根据感兴趣的宿主测量值的平均值分离数据，并创建高和低组。如果OTU在这两组之间有显着差异，并且与门分析中发现的相关方向相匹配，则被认为是潜在的重要OTU。另外，还采用线性混合效应模型分析了随机森林分析后Boruta特征选择（30）鉴定的OTUs以及对照和GOLD第4阶段的鉴别，并与microCT，定量组织学和基因表达数据进行比较。基因组富集分析（GSEA）被用于比较整个基因表达数据集中的相似性。在线补充提供了有关全面数据分析的更多详细信息。
2.结果
表1和在线补充表E1-E3总结了有关年龄，性别，吸烟史，肺功能，每次分析所用组织样本的数量以及本研究中所有受试者每个样本的读数数据。
OTU丰度测定的微生物多样性随着肺气肿破坏的增加而下降（图1），OTU丰度与肺泡表面积呈线性相关（R2 = 0.27）。在应用第二个独立方案评估微生物组之后，这被证实（图E1）。 此外，基于ERMANOVA（31），PCA显示GOLD 4期肺组织样品与对照肺之间的细菌群落差异（图1B; P = 0.001）。这种差异也可使用替代协议发现（图E1B）（P，0.01）。 尽管GOLD第4期COPD患者肺部样本的香农多样性趋势较低，但这一差异仅在位置6的样本（图1C）中有统计学意义（P = 0.05）（1 =顶点，12 = 基础）。 对照，GOLD阶段4和阴性水对照组织样品的香农多样性指数分别为3.40 6 0.24,2.25 6 0.69和1.6 6 0.1（平均6 SD）。
GOLD4期和对照肺之间细菌门的相对丰度不同（P <0.05）（图2A）。在Bonferroni事后检验的基础上，变形杆菌门的扩大是对照和GOLD第4期差异的最显着的驱动因素（P <0.05）。总体而言，两组之间差异最大的是Proteobacteria（对照，46 6 16％; GOLD 4期，66.0 6 1.6％），厚壁菌（对照17.7±19.6％; GOLD 4期7.04±0.87％） ，和拟杆菌（对照，31.7±11.3％; GOLD分期4,21.1±6 4.1％）。根据Boruta特征选择和随机森林分析，变形杆菌流感嗜血杆菌属于对照区和GOLD4期细菌微生物群（图2B）区分的10个OTU。尽管在GOLD第4期COPD肺组织中大部分这些细菌种类大量减少，但是显着的例外是Elizabethkingia meningoseptica （图2C）。在线补充（表E4）中可以找到两种重要OTU方法的相似性和差异性。
为了确定污染，针对方案1和方案2的阴性的水对照进行了随机森林分析（图E2和E3），通过Boruta特征选择鉴定的重要的OTU评估。 除方案1中的链球菌外，所有鉴定为GOLD第4期肺组织的OTUs均含有低相对丰度，或者在阴性对照样品中完全没有鉴定（图E2和E3）。
表2总结了通过比较门的水平上的微生物组数据与根据Vv测量的宿主响应获得的结果的浸润炎性免疫细胞所占的肺组织。这些比较表明香农多样性与CD41淋巴细胞浸润呈负相关，香农多样性与肺表面积呈正相关。 OTU丰度与CD41淋巴细胞浸润呈负相关。进一步的分析显示嗜中性粒细胞浸润与变形杆菌，Comamonadaceae，假单胞菌和Betaproteobacteria OTUs的存在呈负相关（表2和3）。此外，还表明嗜酸性粒细胞浸润和弹性蛋白含量与放线菌OTU呈正相关，Propionibacterium，Micrococcaceae和Atopobium OTUs和B细胞浸润呈正相关。
表4中的数据总结了通过随机森林分析选择的预测性OTUs与定量组织学和微观CT结果之间的关系。 这些数据表明，中性粒细胞浸润的Vv与Dialister（假发现率[FDR] = 0.0001），类杆菌（FDR = 0.03），链球菌种类（FDR = 0.06）和流感嗜血杆菌（FDR = 0.06）呈正相关。 每毫升终末细支气管数量与流感嗜血杆菌和拨水栓菌均呈正相关（FDR，0.05）。 E. meningoseptica与弹性蛋白Vv，CD41 T细胞和Lm（FDR，0.1）呈正相关，与总肺泡胶原（FDR = 0.09）呈负相关。 琥珀酸黄杆菌与CD41T细胞呈负相关，黄杆菌与肺泡表面积呈正相关（FDR，0.06）。
微生物组成的变化与多宿主基因表达的差异相关。我们鉴定了859个基因，其表达与来自Firmicutes门的细菌的存在相关，其FDR截止值小于0.1（表E6）。 DAVID分析表明，下调的基因主要涉及锌指结构域（FDR，2.5×103 10），而上调的基因涉及二硫键，信号肽，膜和防御反应途径（FDR， 2 3 1023）。如果使用0.05的FDR截止值而不是0.10（数据未显示），则该结果不会改变。 另外，Proteobacteria与FDR为0.1以下的235个基因有关（表E6）。 从下调的基因中没有鉴定到通路，但是上调的基因涉及剪接，纤毛，细胞投射和细胞 - 细胞连接的通路（FDR，0.1）。当分析最重要的预测性细菌OTUs与人类宿主基因表达的相关性时，只有流感嗜血杆菌与低于FDR截止值0.1（C21orf51，FDR = 0.05）的单个基因相关联。 GSEA分析比较来自方案2的宿主基因表达与来自方案1的微生物组的表达，显示相同的基因与香农多样性和OTU丰度相关地上调和下调（表E5和E7以及图E4和E5）。
3 讨论
目前的结果证实了早期的报道，显示成人肺部含有一种稀少但相对复杂的微生物组，使其密度得以维持，而在COPD患者的肺部变得不那么多样化（15,26,32）。通过用于扩增V3-V5区域的降落PCR（方案1）和用于扩增相同细菌16S rRNA基因的V1-V3区域的巢式PCR（方案2）两者均扩展了这些观察结果， OTU减少与肺表面的肺气肿破坏有关（图1A和图E1A）。两种方法也表明在GOLD第4期COPD患者和对照肺组织之间的微生物群落组成也有差异（图1B和图E1B）。此外，他们证实并延伸了先前的报道（13），（图2）与对照相比，COPD患者变形菌门和放线菌较小程度的扩张，而由于作为肺泡表面被破坏，厚壁菌门和拟杆菌门收缩。 最重要的是，他们表明这些变化在肺组织中产生可测量的宿主反应。
Salter及其同事的一项研究（33）强调了样本污染是稀少而相对多样的微生物组（如肺）的重要原因。因此，本研究中随机森林分析确定为重要的一些OTUs（显着黄杆菌和链球菌），也与鉴定为潜在污染物的属( 33 )不一致，这是令人关切的。尽管我们的样品中包含的阴性对照显示，在阴性对照样品中，这些相同的OTUs不存在或大大减少(图E2和E3 )，但我们不能最终排除污染，因为污染在所鉴定的一些细菌中起作用(例如黄杆菌、脑膜炎球菌和透析菌)。因此，这些发现需要谨慎解释，直到开发出更精确的方法来排除污染生物体。
随机森林分析显示(图2B )能够最好地区分来自对照受试者的肺组织和重度金期4 COPD患者的 OTUs，具有阳性和阴性效果。例如，在非常严重的GOLD4 COPD中观察到流感嗜血杆菌几乎不存在，并且随着在较轻形式的COPD中看到的末端细支气管的数量而增加。这可能暗示了一种保护现象，这种现象以前已经在小鼠身上得到证实, 其中流感嗜血杆菌和肺炎链球菌同时接种到上呼吸道粘膜表面上表明，流感嗜血杆菌通过诱导宿主反应而与肺炎链球菌竞争粘膜表面，所述宿主反应导致中性粒细胞破坏肺炎链球菌( 34 )。这些观察结果提示了流感嗜血杆菌能够在COPD早期引起感染并产生急性加重的假设( 7 )。此外，这也符合这样的假设，即与COPD进展相关的末端细支气管的减少和肺气肿破坏的增加破坏了有利于流感嗜血杆菌出现的生境，并允许不同的微生物组在晚期COPD中出现、定植和感染肺组织。此外，流感嗜血杆菌空出的组织可能为某些外来细菌(例如脑膜炎球菌)提供生态位，这些细菌与炎症免疫细胞浸润和与COPD进展相关的组织重塑相关。然而，需要进一步的研究，考虑到所有的污染纠正报告，以获得最佳的描述主机对慢性阻塞性肺病微生物组的反应。
在本研究中，变形杆菌和类杆菌(较小程度地)的相对扩张，对厚壁菌门和拟杆菌门收缩的发生，,这与肺气肿破坏所形成的肺泡表面减少的空间竞争一致。例如，扩展的变形细菌门(图2 )贡献了与中性粒细胞浸润相关的所有五个单独的otu和与B细胞浸润相关的四个otu中的一个(表2和3 )。放线菌门较小的扩张带来了与B细胞浸润有关的四种OTU中的三种以及与嗜酸性粒细胞浸润的强烈关联。相比之下，厚壁菌门不包含任何与特异性反应相关的OTUs，类杆菌门仅包含脑膜炎球菌，这有助于将对照与GOLD4 COPD病例分离。总的来说，这些数据表明，位于扩张门内的OTU随着肺泡表面被破坏，比宿主的门OTU更大程度地刺激宿主反应。此外，他们还提出了这样的假设，即成功竞争收缩细支气管和肺泡表面的生物体被宿主免疫监视系统识别，而宿主免疫监视系统通常对肺的细菌微生物群没有反应。
4.讨论
本研究结果证实了先前的报道，即成人肺中含有稀少但相对复杂的微生物群，相对复杂使这些微生物群落可以维持数量，但在COPD患者的肺中其多样性较小(15, 26, 32)。他们还通过用于扩增V3 - V5区的降落式PCR (方案1 )和用于扩增相同细菌16S rRNA基因的V1 - V3区的嵌套PCR (方案2 )显示，OTU丰富度的下降与肺表面的肺气肿破坏相关(图1A和图E1A )。两种方法在GOLD第4期COPD患者的肺组织和对照肺组织之间的微生物群落组成也有差异（图1B和图E1B）。 此外，他们通过显示（图2）证实并延伸了先前的报道（13），与对照相比，变形杆菌和较小程度的放线菌扩张，而由于肺泡表面被破坏 受COPD影响的肺气肿导致厚壁菌门和拟杆菌门的收缩。 最重要的是，他们表明这些变化在肺组织中产生可测量的宿主反应。
Salter及其同事的一项研究（33）强调了样本污染是稀疏而相对多样的微生物组（如肺）的重要来源。因此，一个值得关注的问题是，本研究随机森林分析（显着黄杆菌和链球菌）确定为重要的一些OTU也不符合被鉴定为潜在污染物的属。尽管我们的样品中包含的阴性对照显示这些相同的OTU在我们的阴性对照样品中不存在或大大减少（图E2和E3），但是我们不能确定地排除污染在一些鉴定的细菌中起作用（例如， （Flavobacterium），脑膜炎奈瑟氏球菌（E. meningoseptica）和拨液器（Dialister））。 因此，需要谨慎解读这些发现，直到制定更加精确的排除污染生物体的方法。
随机森林分析显示（图2B），最能区分对照组受试者和严重GOLD 4期COPD患者肺组织的OTUs有正面和负面的影响。 例如，在非常严重的GOLD第4期COPD中观察到流感嗜血杆菌实际上不存在，并且与在较轻度COPD形式中看到的末端细支气管的数目相关地增加。 这可能提示先前已经在小鼠中证实的保护性现象，其中在上呼吸道粘膜表面上同时接种流感嗜血菌和肺炎链球菌显示流感嗜血杆菌通过诱导宿主反应外部竞争肺炎链球菌粘膜表面，导致嗜中性粒细胞破坏肺炎链球菌（34）。这些观察结果提示了流感嗜血杆菌在慢性阻塞性肺疾病早期能够引起感染和急性加重的假说[7]。此外，这也符合这样的假设，即终末支气管下降和与COPD进展相关的肺气肿破坏的增加破坏了有利于流感嗜血杆菌出现的栖息地，并且允许不同的微生物集合出现，定殖和感染晚期COPD肺组织。此外，流感嗜血杆菌所腾出的组织可能为某些外来细菌如脑膜炎奈瑟球菌（E. meningoseptica）提供了一个生态位，与本研究中与COPD进展相关的炎性免疫细胞浸润和组织重塑有关。 然而，需要进一步的研究，考虑到所有的污染纠正报告，以获得最佳的描述主机对慢性阻塞性肺病微生物组的反应。
在本研究中，变形杆菌和放线菌的相对扩张，和厚壁菌和拟杆菌门的收缩，这与肺气肿破坏所形成的肺泡表面减少的空间竞争一致。例如，扩展的Proteobacteria门（图2）贡献了与嗜中性粒细胞浸润相关的所有五个OTU和与B细胞浸润相关的四个OTU之一（表2和3）。放线菌门较小的扩张带来了与B细胞浸润有关的四种OTU中的三种以及与嗜酸性粒细胞浸润的强烈关联。相比之下，厚壁菌门不包含任何与特定反应相关的OTU，并且拟杆菌门仅含有肠膜炎奈瑟球菌，其有助于将对照从GOLD阶段4 COPD病例中分离出来。总的来说，这些数据表明，位于扩张门内的OTU随着肺泡表面被破坏而扩大，比收缩的门OTU更大程度地刺激宿主反应。此外，他们提出这样一个假设，即成功竞争细支气管和肺泡表面的生物体被宿主免疫监视系统所识别，该宿主免疫监视系统通常对肺的细菌微生物群体没有反应。
基因表达谱分析数据显示859和235个基因的上调或下调，提供了额外的证据，以支持宿主对细菌微生物组成的变化的强烈响应，所述基因的表达在FDR截止值小于0.1（表E6）的Firmicutes或Proteobacteria门。此外，GSEA分析显示，使用方案1和方案2，许多与宿主基因变化相关的细菌在方向上是相同的。另外，基于DAVID的方案2的分析显示香农多样性与清除粘膜表面所需的动力蛋白，卷曲螺旋，纤毛和微管运动活性途径（FDR，0.0004）中的基因正相关。另一方面，香农多样性与涉及免疫球蛋白，糖蛋白和Fcγ受体III途径（表E7，与免疫反应有关）的基因表达之间存在负相关性。
1996年，Fredricks和Relman（35）对Koch的假设进行了升级，以基于测序技术鉴定微生物鉴定。 这些修订的标准包括以下内容：
- （1）推定病原体的核酸序列必须优先存在于已知患病器官内的器官或解剖部位;
- （2）受影响器官的非发病区域应当少有或没有该序列的副本;
- （3）疾病的消退应该与拷贝数减少相关，并且随着假定病原体的拷贝数增加而复发;
- （4）如果序列检测早于疾病，且与疾病进展相关的拷贝数增加，则因果关系更可能;
- （5）从可用序列数据推断的微生物的性质与被认为是有责任的那组生物体的已知生物学特性一致;
- （6）应采用原位杂交技术来揭示细胞水平上生物体与疾病的关系;
- （7）微生物因果关系的所有基于序列的证据形式应该是可重复的。
尽管目前的结果不能满足所有这些标准，但步数据显示扩展的变形杆菌和放线杆菌内的OTUs是所有在炎性免疫细胞浸润之间观察到的关联OTUs根据这些发现，我们推测与COPD进展相关的持续性低水平炎症性免疫反应（4）主要由扩展门内的OTUs驱动，其随着细支气管和肺泡表面逐渐消失而扩展 COPD（21）。此外，我们认为由这些变化所产生的环境允许在这些扩大门内的特定OTUs加剧COPD急剧恶化，肺或能进行性下降。
本研究的一个重要限制是需要从少数个体中研究相对大量的样品，以观察相同遗传背景个体中疾病的进展。个体内疾病的异质性和终末细支气管在气肿破坏发生前被破坏的观察结果使得可以评估不同水平的组织破坏的反应（21），但是对更大数目的病例的未来研究包括更好的方法 评估宿主对特定微生物抗原的反应是必要的，以确认目前的结果。尽管有这个明显的缺点，但是这里描述的实验方法提供了初步的证据来支持COPD中存在宿主对微生物组的反应，并且主要针对扩大的Proteobacteria和Actinobacteria门中的OTUs，已经成功地竞争了肺泡表面减少空间 。此外，尽管接受移植的患者在移植时没有一个患者发生恶化，但我们推测存在于肺微生物群中的环境可能鼓励来自扩张的变形杆菌门内的菌株的出现，这已知有助于许多产生急性COPD急性加重的菌（36,37）。
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