摘要

尽管不依赖培养的技术已经显示肺部不是无菌的，但对于慢性阻塞性肺病（COPD）中的肺微生物组却知之甚少。我们使用16S扩增子的焦磷酸测序法，以两种方式分析肺微生物群：首先，使用支气管肺泡灌洗（BAL）来对远端支气管和空气样本进行取样;其次，通过检查在移植时移除的六个受试者的肺中的多个离散的组织部位。我们三个不吸烟者（NS）与肺活量正常，七名吸烟者肺活量正常（“’健康烟民”，HS）和四个慢性阻塞性肺病（CS）患者进行BAL。在所有受试者中发现细菌16s序列，组间没有显着的数量差异。基于分类学和独立于分类学的方法揭示了HS患者(与健康NS相似)和两名轻度COPD患者细菌群体的异质性。中度和重度COPD患者的社区多样性非常有限，28％的健康受试者也注意到这一点。两种方法都显示了三个研究组的细菌群落之间广泛的成员重叠。没有一个属是在一个小组内常见，但在整个小组中是独一无二。我们的数据表明核心肺部菌群的组成，包括假单胞菌属，链球菌属，普雷沃，梭杆菌属，嗜血杆菌属，韦荣球菌，和Porphyromonas的存在。最显著的是，在晚期COPD受试者的同一肺内的细菌群落中存在显著的微解剖学差异。这些研究进一步证实了肺微生物组，并强调了严重COPD患者这些细菌群落的全局性和微解剖变化。

1.介绍

慢性阻塞性肺疾病（COPD）是一种进展性和潜在的致命性肺部疾病，预计到2020年将成为全球第五大负担疾病[1,2]。 COPD的特点是气流受限，粘液分泌过多，小气道纤维化，肺泡腔破坏（肺气肿）[3]。在发达国家，COPD的主要原因主要是直接的烟草烟雾暴露，而在发展中国家，生物质燃料燃烧产生的室内空气污染也有显着贡献[4]。并不是所有的吸烟者都会患慢性阻塞性肺病，但为什么有些人患病目前还不知道。由于目前没有治疗阻止COPD进展，所以迫切需要对其发病机制进行新的认识。

慢性阻塞性肺疾病（COPD）的初始是无结核病患者咳嗽和气促的独特临床病症[5]，关于下呼吸道细菌在其发病机制中的作用存在很大争议。这是长期的早期无症状期和直到最后的急性加重期的情况，后者会导致肺功能的加速和持续丧失。在某种程度上由于经典的，基于培养的研究表明，健康个体的肺部是无菌的[8,9,10]，而COPD患者的肺部被认为是被细菌殖民。最近，不依赖培养的微生物学技术证明肺部在健康期间不是无菌的，并且在几种肺部疾病中记录了肺微生物组的变化[11,12,13,14,15]。尽管如此，肺细菌微生物组在COPD发病机制和发展中的作用仍然不明确。

我们的两个目标是解决了与吸烟和COPD有关的肺微生物组的理解上的两个鸿沟。首先是通过分析支气管肺泡灌洗液（BAL）对肺部微生物组进行评估有没有疾病迹象或肺功能下降（“健康”的吸烟者），并且将其与健康不吸烟者比较。第二个目标是通过分析来自手术外植体的多个样本位点，确定是否肺部微解剖/微环境差异导致COPD中局部细菌群落结构的差异。我们通过大量平行的细菌16S扩增子的焦磷酸测序分析这两种类型的样品，这种技术提供了驻留肺微生物组的独立于培养物的分析，并提供了以前用于肺生物学和疾病研究的分析的广度。

2.材料和方法

2.1 道德声明

所有的临床调查都是根据赫尔辛基宣言的原则进行的。该研究方案由密歇根大学医疗保健系统的机构审查委员会和安阿伯退伍军人事务卫生保健系统批准。所有患者均提供书面知情同意书，机构审查委员会已经审查了这些协议，并证明“风险对于受试者的利益和获得的知识而言是合理的，并尽可能减少研究的风险。“

2.2 研究对象- 患者人群

标本来自在ClinicalTrials.gov注册的观察性研究中登记的受试者，标记为NCT00281229。支气管肺泡灌洗（BAL）样本（n = 14）来自在安娜堡医疗保健系统进行研究支气管镜检查的志愿者。在密歇根大学医疗保健系统中，从接受临床指示的COPD肺移植的6名患者获得手术标本（n = 8）。所有受试者均进行术前肺功能测定，PA和侧胸部X线片，心电图，全血计数和自动化学分析，前瞻性收集用药史和临床评估; 手术参与者也进行了胸部计算机断层扫描（CT）的和完整的肺功能测试。我们排除了精神不健全或精神疾病患者知情同意的情况;哮喘，诊断为主要的临床肺部疾病;囊性纤维化，临床上显著的支气管扩张或其他炎性或纤维化肺疾病;和那些服用泼尼松20毫克每日。

肺功能测定被表示为所包括人群的适当预测方程的函数[16,17]。我们采用全球慢性阻塞性肺疾病倡议（GOLD）的肺功能分类对受试者进行分类[18]。对于BAL队列分析，受试者分为三组：健康吸烟者（HS），没有证据表明支气管扩张，支气管扩张剂后FEV1 / FVC.0.70和FEV1％.80％预测; 从未吸烟者（NS）没有吸烟史或肺部疾病证据，支气管扩张剂后FEV1 / FVC.0.70和FEV1％.80％预测; 具有支气管扩张，剂后FEV1 / FVC的COPD受试者（CS），0.70和FEV1％，80％预测。

2.3 样本

根据已发表的指南[19]，使用雾化和滴注利多卡因，静脉注射芬太尼，咪达唑仑，以及在某些情况下使用苯海拉明，志愿受试者接受纤维支气管镜检查。最初，我们通过使用粘稠的利多卡因（2％）麻醉鼻孔进行了支气管镜检查，但对于最后的11个，通过口腔进行支气管镜检查以使污染最小化。将支气管镜依次楔入右中叶和舌骨的一个子区域，每个区域用共120ml生理盐水灌洗，加热至体温，用30ml注射器手动抽吸去除体温。将总回收量集中并立即运送到实验室，其余15ml未处理的BAL液保留用于微生物组分析，然后将剩余的处理用于其他研究研究。将BAL平均分配到2毫升Eppendorf管中，在微量离心机中于4℃以13,000rpm离心30分钟，弃去上清液，将沉淀在液氮中快速冷冻，并储存在-80℃。

在移除后立即获得肺外植体，并使用适当的生物安全预防措施在医院病理学实验室中在层流罩中无菌切割。通过矢状或冠状切割肺外植体以暴露气道进行取样。从近端开始分离气道，并从上部，中部和下部叶的节段和远端部分顺序收集1cm 2组织样品，并分开处理。仔细记录采样的解剖位置，使气道结构与放射影像相关。

2.4 CT检查

使用64排检测器CT扫描仪（GEMedical Imaging，Wisconsin，USA）获取高分辨率计算机断层扫描（HRCT）图像。在初始的前后和侧面计划图像后，以体积方式获得仰卧吸气轴向图像。没有静脉注射造影剂。获得的图像是1.25mm厚的图像，每1.25mm间隔以1.375：1的间距获得，使用120kvp，可变管电流（基于身体习性在80-375mA范围内），0.5-0.6s管旋转速度噪声指数为22.这些图像使用骨骼算法重建，并使用常规肺窗设置（窗宽1300 HU，窗水平-600 HU）进行观察。

2.5 DNA分离

为了从BAL样品中提取DNA，将含有样品沉淀物（对应于5ml BAL）的管悬浮在总共500ml细菌裂解缓冲液（BLB）（Roche Diagnostics）中，然后转移到2ml珠打浆管（Mo Bio）。将样品在Mini Bead-Beater 16（Biospec）中匀浆1分钟，然后在固定角度的微量离心机（Microfuge 18，Beckman Coulter，Indianapolis，IN）中以13,000rpm离心1分钟。随后，向每个样品中加入40ml蛋白酶K，然后在65u下孵育10分钟，然后再次打珠1分钟，然后全速离心1分钟。最后，将管在95℃温育10分钟。使用MagNA Pure Compact系统和核酸分离试剂盒I（Roche，Indianapolis，IN）从这些裂解物中收集DNA。使用NanoDropH ND-1000分光光度计（Nanodrop Technologies）定量DNA浓度。我们通过相同的程序从肺组织样品中分离DNA，除了每个珠子跳动步骤的持续时间增加到2分钟。

2.6 16S定量PCR

qPCR用于量化我们样品的16S含量。使用以下方案在Lightcycler 480（Roche）上进行反应：50℃2分钟，95℃10分钟，然后是95℃15秒和60℃60秒的45个循环。读数采用单采集模式。引物和探针由正向引物TCC TAC GGG AGG CAG CAG T，反向引物GGA CTA CCA GGG TAT CTA ATC TT和16S特异性探针59-FAM / CGT ATT ACC GCG GCT GCT GGC AC / 39-TAMSp。标准曲线使用来自1000ng开始的24倍的肝细螺杆菌DNA（已知在其基因组中具有单个16S基因拷贝的细菌）的24倍稀释液构建。样品一式两份地以1:10和1:100倍稀释。

2.7 454焦磷酸测序

使用针对16S rRNA的V1-V3可变区的细菌标签编码的FLX-Titanium扩增子焦磷酸测序（bTEFAP）方法来产生扩增子文库[20]。 V1-V3引物组对应于27F（59- GAGTTTGATCNTGGCT-CAG-39）和519R（59- GWNTTACNGCGGCKGCTG-39），以及合适的样品核苷酸条形码和罗氏A＆B引物。焦磷酸测序按照既定方案进行[21]。

2.8 数据分析

分类: RDP分类器（http:// rdp.cme.msu.edu）的本地运行版本用于16S rDNA序列的系统分类。包括少于50个核苷酸的序列，没有有效条形码的序列或具有错误位置的条形码的序列作为低质量读取被去除。 50％的置信阀值被用来产生准确的分类学鉴定[22]。数据表是从分类器输出中构建的，并使用几个自定义R脚本和R的vegan包（http://CRAN.R-project.org/package=vegan）[23]进行分析。
操作分类单元（OTU）：开源的、平台无关的，社区支持的软件程序mothur（http://www.mothur.org; [24]）被用来处理和分析序列数据。使用上述质量控制程序清理和过滤序列读数，预聚簇和消除嵌合体。使用OTU截断差异值3％进行16S rDNA分析，并遵循Costello粪便分析实例（http://www.mothur.org/wiki/Costello_stool_analysis）。
统计分析：统计分析使用Prism 5（GraphPad软件）进行单向ANOVA和R（http：//www.r-project.org）。

3 结果

表1列出了接受BAL治疗的14例患者的特征。年龄40-78岁（中位53.9岁），7/14男性和8/14目前正在吸烟。 6例接受肺移植治疗的晚期COPD患者是严重气流阻塞的男性（表2）。一个患有与α-1抗胰蛋白酶缺乏相关的肺气肿（CS＃6）。

为了解决我们确定三组细菌总数是否有差异的第一个目标，我们从高速离心后的BAL沉淀中分离总DNA，并通过qPCR测定16S基因拷贝数。在我们的研究中的每个样品中，检测到显着水平的细菌16S基因信号（图1）。三个研究组之间没有显着差异（Log 16S拷贝数/ ml BAL：HS，8.2560.25; CS，8.1260.40; NS 8.2460.66平均6个SEM; p.0.05）。总之，在我们的14名受试者的BAL液中检测到的细菌水平与之前以气道无菌刷洗为基础的估计相一致[12]。因此，在所有受试者中都有显着的细菌水平，在从不吸烟者和终末期肺病者之间没有显着差异。

为了比较受试者之间和组间的肺部微生物群落的细菌群落结构（成员和多样性），我们接下来使用454焦磷酸测序来分析从BAL样品产生的16S扩增子文库。在对序列进行质量控制过滤之后，我们使用RDP分类器[25]将分类分配给序列进行生态分析。与我们的qPCR分析（图1）一致，在每个BAL样品中容易识别肺驻留细菌群（图2和表3）。几乎所有的过滤后的reads（91％61.5％均值6SEM）可以归类到属水平，不论受试者队列。我们受试者肺部的主要门是Proteobacteria，Firmicutes和Bacteroidetes（图2A）。在门的水平上，大多数HS组的细菌群体存在异质性，与健康从不吸烟者（NS）和我们两位轻度COPD患者（CS＃1和CS＃2）(二者相似) 。相反，中度和重度COPD患者（CS＃3和CS＃4）缺乏细菌群落多样性，值得注意的是，这在两个健康受试者（HS＃4和HS＃7）和一个从不吸烟者（NS＃2）也一样。

在属水平（图2B），健康吸烟者（HS）和从不吸烟者的细菌群落是相当多样的，除了每个组别（HS＃4和NS＃2）中的一个人外。对于样品中存在的每个门类，通常存在一至两个占多数的属（例如，假单胞菌属，链球菌属，普雷沃菌属，梭杆菌属或韦荣恩氏菌属;图2B和表3）。在两名轻度COPD患者（CS＃1和CS＃2）中也观察到类似的多样性，但在具有更严重疾病的COPD受试者（CS＃3和CS＃4）中观察到多样性的损失。总的来说，我们受试者的肺微生物群是多样的，但是比口腔和肠道细菌群通常发现的更为有限[26,27]。

接下来，我们使用主成分分析（PCA，图3A）分析了属细菌群落数据，以创建一个群落秩序，并检查哪些元素对受试者之间的变异影响最大。这种方法揭示了HS，CS和NS组细菌群落之间的广泛重叠。没有细菌在一个小组内是共同的，而是在各个小组之间是独特的（从而将一个小组与另一个小组分开）。因此，在肺部微生物群主要由一个细菌属为主体的受试者中，合理的解释是从社区内生长而不是入侵。

我们的数据还表明，可能存在组成“核心”肺部微生物组的细菌，即在健康受试者的BAL中以非常高的频率（全部16s读数的>1％）被发现。在超过75％的受试者中发现的候选属包括假单胞菌，链球菌，普氏菌和梭杆菌（表3和图3B）。在超过一半的样本中也鉴定出嗜血杆菌，韦荣韦氏菌和卟啉单胞菌。

我们还通过自组装操作分类单元（OTU）分析的互补方法分析了16S焦磷酸测序数据，该分析消除了分类学方法中固有的任何潜在的分组偏差。对于参考，在基因组水平上和物种水平上，我们选择两个全长16S序列之间3％的差异[28]。我们使用这种相似度来生成OTU，并使用Shannon多样性指数的非参数形式计算多样性指数。与分类学分析（图2B）相一致，基于OTU的分析（表4）证实，在健康吸烟者（HS）中存在多种细菌群落（更高的Shannon值表示更高的多样性），这与在健康的非吸烟者（NS）和两名轻度COPD患者（CS＃1和CS＃2）相似。这一分析再次确定，在中重度COPD患者（CS＃3和CS＃4）中肺微生物组的多样性较小（表4）。

为了得到物种平均物种丰富度的估计值，我们还比较了基于分类器方法的属的数量和在3％同一性水平上的OTU的数量。我们将分析的范围限定在>1％的属的数目和>1％的OTU的数目。重要的是，这种分析表明，人类肺部微生物的种水平上的多样性是非常有限的：每个受试者每个属约2个OTU，除了CS＃3有10个之外（表4）。总体而言，基于OTU和基于分类器的方法均表明，所有受试者的肺都含有不同的常驻细菌微生物群，其在亚属水平上仅显示有限的丰富性。

为了解决BAL样品中细菌是否可能反映手术中使用的支气管镜上气道污染的关键问题，我们从移植过程中移除的8个COPD肺外植体（6个单个和2个双侧移植物）取样多个组织部位。所有取自外植肺的组织都含有容易识别的细菌群落（图4）。因为BAL在部分或亚段支气管远端的多个气道和肺泡上采样，所以我们首先将来自所有手术标本的单个肺叶的组织样本中的所有个体测序读数结合起来，并进行单独的分析。在所有三个样品中，假单胞菌属（图4A，组织）中的三个叶片中的每一个的细菌群落概况都是主要的，这与来自我们严重COPD受试者（CS＃4）的BAL样品非常相似，的其他人（图2）。因此，外植体组织的直接取样显示BAL样品中的细菌群落是肺部驻留的微生物，而不是支气管镜污染的结果。

我们接下来比较个别组织部位以确定晚期COPD受试者的肺内的细菌群落中是否存在微解剖学差异。每个叶具有四到八个不同的组织部位取样，总共44个组织部位。对于在这些受试者中采集的任何组织部位，手术前CT图像中没有明显的支气管扩张变化。图4b显示了两名患者的说明性CT图像;其他四名患者的结果相似（数据未显示）。然而，尽管结构正常，同一肺内的细菌群落组成也有显着差异。这在来自CS＃6主题的左上叶尤其明显。嗜血杆菌在LUL的节段性支气管中占主导地位。Stentrophomonas主要在LUL的远端支气管中。与之形成鲜明对比的是，假单胞菌在同一肺中的上部中上支气管和许多其他部位占主导地位。额外的外植叶还显示微解剖异质性。在CS＃7RL的组织部位之间观察到了最显着的差异，而CS＃8RL中的所有组织部位几乎完全由假单胞菌占优势（图5）。这些数据首次证明了细菌微生物组在区域内存在显著的差异。

我们接下来根据Bray-Curtis距离构建了一个最近邻接树，用于比较CS＃5和CS＃6不同地点的细菌群落之间的β多样性（群间多样性）图6A）。大部分样本的Bray-Curtis距离较低，表明样本彼此更相似。然而，CS＃6 LUL分段和CS＃6 LUL远端样本与主要群组相互分离并且具有高Bray-Curtis值，表明高度不相似性。我们再次使用PCA排序来确定哪些细菌负责驱动个体样本之间的差异（图6B）。这一分析表明样本的微观解剖变异是由假单胞菌属，嗜血杆菌属或嗜血杆菌属单胞菌在该部位的优势驱动的。

对OTUs的分析（基于3％的相异性）表明，同一肺内甚至同一肺叶内组织部位的OTU数量也存在显着的数值差异（表5）。一个令人感兴趣的观察结果是，在由单一属（假单胞菌属）统治的样品中，OTU的数量通常存在显着的异质性。例如，我们观察了CS＃5右叶的一些区域和CS＃3（图2B和表3）的BAL。这些样本的OTU和基于分类器的分析相互一致，清楚地表明在晚期COPD受试者的同一肺内的细菌群落中可能存在显着的微解剖差异。

4.讨论

这项研究使用大规模平行焦磷酸测序细菌16S扩增提供了新的信息，研究对象包括健康的非吸烟者，肺功能正常的吸烟者和轻度或重度肺功能疾病的稳定COPD受试者范围的微生物。我们已经展示了三个重要发现。首先，健康吸烟者的肺含有细菌微生物群，这种微生物群在数量上是显著的，多样的（但成员数量有限），与口腔或鼻咽的报道截然不同[26]。 其次，在肺功能降低的受试者中，肺细菌微生物组的多样性通常较低，最常见的是与假单胞菌属相关。 第三，这是第一个描述肺内众多微解剖位点可以引起细菌群落结构显着差异的研究。

我们目前的研究以前所未有的深度检查肺微生物群，每个样本平均约12000个序列。这个明显更大的测序深度增加了我们对肺的充分采样以准确表征微生物肺部群体的信心。我们从健康吸烟者对BAL的研究与最近在健康个体中的多种细菌肺微生物群的研究是一致的[12]，这项研究在整个研究中总共有3000个序列读数。

重要的是，我们发现一些吸烟者相对于具有正常肺功能的吸烟者而言肺部微生物群较少，表明肺微生物群的改变可发生在没有肺部疾病证据的受试者中。这种多样性的相对减少是否持续，是COPD特征性炎症改变的效果，还是可能部分有助于疾病进展，这些问题都需要大型受试者进行纵向随访。我们的研究结果与另一个胃肠道粘膜部位的发现一致，微生物群多样性的下降与炎症性肠病的发病率增加有关[30,31]。肺部社区生态失调可以提供长期以来在COPD中观察到的持续的炎症刺激[32]。因此，在肺部，与粘膜上的其他部位一样，多种微生物可能对健康很重要，包括定植耐受，上皮完整性和免疫调节[33,34]。

总的来说，我们的研究结果为描述假单胞菌和嗜血杆菌在COPD的发展，进展和/或恶化中的作用提供了一个统一的框架。在使用独立于培养的技术之前，嗜血杆菌是从COPD肺样品中最常生长的有机体[35]，经常提到假单胞菌[36]。目前的工作表明，即使在健康的条件下，这些生物体一般也存在。尽管必须进行更大规模的研究，但是我们的数据支持一个模型，肺微生物群落中的生物优势与疾病相关。

我们还表明，由于肺通气微结构的局部差异，来自肺部不同气道的样本可能含有非常不同的细菌群落。这一结果在一个移植接受者的左上叶气道中最为明显（图4），其中细菌群落主要为细菌属（嗜血杆菌），在其他气道中未高水平检测到。先前的研究[12]发现在左上叶的无菌刷样品中COPD与嗜血杆菌属（Haemophilus spp）存在显著相关性。一开始，这一发现似乎与假单胞菌属（Pseudomonas spp）的统治有冲突。我们研究的BAL样本和气管内吸出物在COPD严重急性加重研究中的作用[13]。然而，由于COPD病理可能是解剖学异质性的，我们观察到肺微结构允许在疾病期间发展不同的局部微生物群落，为所有关于细菌在COPD进展中的作用的基于培养物和独立的研究提供了统一的假设。

肺部空间上不同的细菌群落的证明对于我们对肺部健康和疾病的理解可能是非常重要的，因为微生物组的解剖变异正在成为解剖其他身体部位疾病机制的焦点。例如，皮肤易发炎的地区，与相邻的无病菌相比，已经显示出不同的微生物群落[37]。同样，微生物群落结构中的牙齿之间的差异易于同一口腔内的疾病[38]。从机制上看，牙周病牙齿中的微生物群落与富含甲烷的古代牙齿相比，局部富集[38]。虽然这些有机体不是致病的，但有证据表明，它们改变了当地的环境，使已知可导致疾病的细菌得以繁殖。在肺中也可能存在类似的致病性syntropic相互作用。我们观察到肺上叶中最显着的微解剖差异，这与临床观察结果一致，即COPD中肺气肿最常见于上叶。

我们的研究认识到的局限性包括缺乏口咽样本和相对较小的样本量。而后者是未来研究的问题，前者将在这里处理。作为肺部微生物学研究对照的口咽样品根植于肺部应该是无菌的信念;因此，口咽样本的目的是排除污染。但是，尽管没有这个样本，我们可以证明我们确定的肺微生物群不是污染的结果。首先，在受试者BAL中检测到的16S水平太高而不能与污染物一致（图1），但高到足以与低水平定植一致。其次，BAL样品中变形杆菌，特别是假单胞菌属的支配与由放线菌门占优势的鼻腔和以厚壁菌属为主的口咽组织完全不同[26]。在一些受试者中，变形杆菌已被证实在口咽部有较大的存在，但从未遇到过假单胞菌[26]。最后，当从取出的肺部的气道直接取样时，鉴定的细菌与在BAL样品中鉴定的相同。然而，我们所有的高级COPD外植体缺乏在“健康吸烟者”控制中观察到的多样性。总的来说，这些数据强烈地认为，肺部气道是一个独立的微生物栖息地，我们的结果不仅仅是污染的结果。

总之，这些结果表明，在研究COPD时，需要以系统的，解剖学相关的方式考虑肺部微生物群落和宿主炎症反应。我们相信CT成像将是这一努力的核心。通过证明一个人的肺可以包含“健康的”微生物群的广泛区域和单个部位包含“致病性”群落，我们的结果提示了肺病原体和宿主免疫力的相互作用可能贡献的机制，即使在没有明显的恶化的情况下也可以局限于疾病进展。

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“健康”吸烟者和慢性阻塞性肺疾病肺部微生物群的分析

微生物学习笔记

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