这篇综述回顾了DNA测序技术发明四十周年以来的发展历程，规模从几个碱基对第一个人类基因组，我们已经见证了多个技术革命和增长，现在获得的百万人和其他多种的基因组。DNA测序技术已被广泛地使用，包括作为一个广阔的分子的计数器。我们预测，从长远来看，DNA测序的影响将可与显微镜相提并论。
1.DNA测序技术的历史
早期测序
最早是胰岛素（蛋白质）和tRNA早于DNA完成了测序。其中，第一个RNA测序用了140kg的酵母测出了76个核苷酸。
DNA测序技术的发明**
1973年Gilbert和Maxam引物延伸法测定了24个核苷酸，每个核苷酸在耗时一个月。
1976年Sanger和Coulson链终止法和Gilbert和Maxam化学裂解法。
1979年鸟枪法测序
1987年Smith、Hood和Applied Biosystems开发了桑格法荧光测序仪，1000base/d。
1982年Genbank上存储了500,000bases.
1986年Genbank上存储了10,000,000bp.(统计数据见 https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/statistics/）
扩大到人类基因组
1.几个显著进步：1）从染料标记的引物到染料标记的末端; 2）突变的T7 DNA聚合酶; 3）线性扩增反应；4）基于磁珠的DNA纯化和提取；5）PE双端，双链测序；6）毛细管电泳；7）工业化标准的加入。
2.软件的开发：phred，质量度量Q值, phrap, the TIGR assembler and the Celera assembler
3.测序成本的下降:2001年一个测序中心可以测10,000,000bp/day. 2004年￥1/（600-700bp).
4.和HGP计划平行进行的私人基因组测序Craig Venter and Celera (2001)。
大规模平行DNA测序
1.核心是体外扩增产生每个模板拷贝被测序，而不是细菌克隆。
2.几种扩增方式有polonies，桥式pcr或者滚环扩增（纳米球）。
3.边合成边测序的三种方式：1）焦磷酸测序2）使用DNA连接酶的特异性荧光寡核苷酸模板附在顺序的方式3）聚合酶介导下逐步加入荧光标记的脱氧核苷酸（1998, Solexa）
4.第一个NGS测序平台是454（2005）, 然后是Solexa（35bp PE）。
5.几个NGS平台454（Roche收购），Solexa ( Illumina收购), Agencourt (Applied Biosystems收购), Helicos (founded by Quake), Complete Genomics (founded by Drmanac华大收购) ， Ion Torrent (founded by Rothberg)。
6.2012年454, SOLiD 和 Helicos停止开发，illumina成为主流，尽管华大是个潜在挑战者。准确度99.9%，Novaseq可以两天内产生1百亿reads，是HGP计划23G的40倍。
单分子实时测序
1.PacBio:零模波导孔，大于10k的读长，10%的原始错误率，很低的gc偏好性。
2.纳米孔测序：Oxford Nanopore Technologies (ONT)，最长读长可达900K, 便携式，电信号检测，但是错误可能不是随机的。
3.两者均可检测碱基修饰，甲基化等。
DNA测序的应用
1.基因组的de novo组装
（1）遗传图谱（2）物理图谱（3）双端测序，8-10冗余，1/100,000的错误率（4）Celera, 从贪婪算法（phrap and the TIGR assembler）到基于图的方法（重叠–布局–共识）（5）de Bruijn graphs (如 EULER and Velvet)（6）高分子量high molecular weight (HMW)（7）HiC
2.基因组测序
1）重测序：Bowtie and Burrows–Wheeler Aligner (BWA)数据压缩，SAMtools and later GATK。
2）几个计划：Genome Aggregation Database (http://gnomad.broadinstitute.org/)
Genomics England ([https://www.genomicsengland.co.uk/](https://www.genomicsengland.co.uk/))
NHLBI TOPMed (TransOmics for Precision Medicine, [https://www.nhlbiwgs.org/])
测序的临床应用
1.无创产前诊断 non-invasive prenatal testing (NIPT)
2.WES： Mendelian and neurodevelopmental disorders
3.癌症：靶向治疗、非侵入性诊断和监测ctDNA, cfDNA,发现新的突变位点。
4.测序仪作为分子计数装置：RNA-seq取代芯片，TopHat and Cufflinks（http://enseqlopedia.com/）
